抗伪狂犬病病毒干扰素刺激基因的筛选及IFIT3抗病毒活性的鉴定

张华伟，李连峰，周 末，杨玉莹，仇华吉*

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州434023；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由PR 病毒(PRV)引起的一种高死亡率的急性传染病[1]。PRV 是疱疹病毒科α 疱疹病毒亚科水痘病毒属的线性、双链DNA 病毒，基因组长约143 kb，编码70～100 种蛋白质[2]。猪是PRV 的天然宿主，一旦感染将会终身带毒。PR 给养猪业造成重大经济损失，严重威胁世界养猪业。

天然免疫系统是机体抵抗病原感染的第一道防线，其中干扰素(Interferon，IFN)和干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)在宿主抗病毒防御中发挥关键作用[3]。单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus，HSV-1)感染宿主后，病毒 DNA 被 Toll样受体、NOD 样受体和RIG-I 样受体等模式识别受体所识别，激活下游信号通路，诱导IFN 的转录表达[4]，进而抑制病毒复制。此外，HSV-1 通过自身编码蛋白拮抗IFN 信号通路，以潜伏感染等方式逃逸宿主天然免疫应答[5]。

PRV 与 HSV-1 同科，其激活 IFN 信号通路与HSV-1 相似。已有报道表明，PRV 感染细胞后，细胞质内的cGAS (Cyclic GMP-AMP synthase)与病毒DNA 结合，cGAS 催化 GTP 和 ATP 合成 cGAMP(Cyclic GMP-AMP)，进而激活STING (Stimulator of interferon genes)蛋白，被激活的STING 招募TBK1(TANK-binding kinase I protein)，并且从内质网移位至细胞核周围激活转录因子IRF3 与NF-κB，诱导IFN 产生，引起下游ISGs 转录表达，发挥抗PRV作用。例如，IFN 诱导表达的25- 羟基胆固醇(25-Hydroxycholesterol，CH25H)能够影响 PRV 的吸附与侵入，进而影响病毒复制[6]。

现已报道了许多具有抗病毒活性的ISG，如Mx1、OAS1、ISG15、ISG20、IFITM1/2/3 和 tetherin等[7-8]。但关于抗PRV 特异性ISGS 目前还不十分清楚，为此，本研究利用高内涵系统筛选抑制PRV 复制的猪源ISGs，并验证相关分子的抗病毒功能，为探究ISGs 的抗病毒分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、质粒、细胞株及实验动物 PRV TJ 变异株由本实验室分离并保存；表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告病毒(rPRV-EGFP)、过表达质粒pCMV-HA-ISGs (pCMV-HA-CH25H、 pCMV-HA- IFI 44L、pCMV-HA-SSBP3、pCMV-HA-ISG15、pCMVHA-ISG20、pCMV-HA-DDIT4、pCMV-HA-IFIT3、pC MV-HA-GBP1、 pCMV-HA-GBP2、 pCMV-HA-Mx1)、pFUGW-EGFP 和pFUGW-IFIT3 质粒由本实验室构建并保存。pCMV-HA、慢病毒载体pFUGW 及辅助质粒psPAX2、pMD2.G 购自Addgene 公司。猪肾细胞(PK-15)、猪肺泡巨噬细胞(PAM)、人胚肾细胞(HEK293T)和非洲绿猴肾细胞(Vero)由本实验室购买并保存。6 只5 周龄PRV 抗原和抗体均为阴性的仔猪购自哈尔滨兽医研究所动物实验基地。

1.2 主要试剂 限制性内切酶SfiⅠ购自NEB 公司；TRIzol、反转录试剂和Premix ExTaqTMMix 购自TaKaRa 公司；胎牛血清FBS 和DMEM 购自Gibco 公司；X-tremeGENE HP DNA 转染试剂购自Roche 公司；质粒提取试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒和DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；CCK-8 试剂盒购自Dojindo 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；猪源 IFN-α 购自 Kingfisher 公司；猪源 PRV阳性血清由本实验室制备并保存；鼠源抗HA 单克隆抗体(MAb)、鼠源抗 GAPDH MAb 和羊抗猪IgG-FITC 购自Sigma 公司；FITC 标记的羊抗鼠IgG购自 LI-COR Bioscience 公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒购自BD 公司。

1.3 重组质粒pCMV-HA-ISGs 表达的检测 将本实验室构建的过表达质粒pCMV-HA-ISGs (pCMVHA-CH25H、pCMV-HA-IFI44L、pCMV-HA-SSBP3、pCMV-HA-ISG15、pCMV-HA-ISG20、pCMV-HA-DD IT4、pCMV-HA-IFIT3、pCMV-HA-GBP1、pCMV-HA-GBP2 和 pCMV-HA-Mx1)与转染试剂按照 1∶1 的比例转染Vero 细胞，48 h 后裂解细胞，经BCA 法测定浓度后，各取100 μg 蛋白，以鼠源抗HA MAb为一抗(1∶1 000)，羊抗鼠 FITC-IgG 为二抗(1∶10 000)，western blot 检测重组质粒pCMV-HA-ISGs 表达的相应蛋白。

1.4 抗PRV ISGs 的高内涵筛选 将Vero 细胞以5×104个/ 孔铺于96 孔细胞板中，待细胞融合度达到80 %时，转染各pCMV-HA-ISGs 质粒。转染20 h后，感染报告病毒rPRV-EGFP (200 TCID50/ 孔)。感染18 h 后，弃上清，每孔加入100 μL 4 %多聚甲醛，室温固定30 min。弃掉固定液，经PBS 洗涤后，加入核染试剂(Hoechest3342)，4 ℃避光过夜孵育，荧光显微镜下扫描并计算病毒的感染评价PRV的复制情况，同时设IFN-α 处理的Vero 细胞为阳性对照组，转染pCMV-HA 空载体的Vero 细胞为阴性对照组。

1.5 IFIT3 过表达细胞系的构建与鉴定

1.5.1 IFIT3 过表达细胞系的构建 以pCMV-HAIFIT3 为模板，用连接有限制性内切酶SfiⅠ酶切位点的引物pFUGW-IFIT3-sfiⅠ(A)-F：ACAGGCCATT ACGGCCATGAGTGAGGTCAACAAG/pFUGW-IFIT3-sfiⅠ(B)-R：TACGGCCGAGGCGGCCTTATCAGCCA CTATTCCAGGC，PCR 扩增IFIT3 基因，测序鉴定正确后，将其克隆至pFUGW-EGFP 载体，获得重组质粒PFUGW-EGFP-IFIT3。将HEK293T 细胞传代于细胞培养皿，待细胞融合度达到80 %时，将重组质粒PFUGW-EGFP-IFIT3 或 pFUGW-EGFP 分别与辅助质粒 pSPAX2 和 pMD2.0G 以 3∶2∶1 的比例转染。转染36 h 后，在荧光显微镜下观察并筛选具有绿色荧光的细胞孔，以获得慢病毒Lenti-EGFP-IFIT3 和Lenti-EGFP；转染48 h 后收集并浓缩两种慢病毒并感染PK-15 细胞，经流式细胞仪分选，获得过表达细胞系PK-EGFP-IFIT3 和对照组细胞系PK-EGFP。

1.5.2 IFIT3 过表达细胞系的鉴定 将裂解的PKEGFP-IFIT3 和PK-EGFP 细胞经BCA 法测定浓度后，各取100 μg 蛋白，分别以鼠源抗GAPDH MAb (1∶1 000)和鼠源抗 EGFP MAb (1∶1 000)为一抗，羊抗鼠 IgG-FITC (1 ∶10 000)为 二 抗 ， western blot 检 测GAPDH 和EGFP 蛋白的表达。其中GAPDH 为内参蛋白。

1.5.3 过表达IFIT3 对PK-15 细胞活力影响的检测将PK-IFIT3、PK-EGFP 和PK-15 细胞计数后，以1×104个/孔接种96 孔板，每种细胞设置3 个重复孔；待细胞融合度达到80 %时，每孔加入10 μL CCK-8溶液。将待检样品置37 ℃孵育2 h 后，检测其OD450nm值。以PK-15 的OD450nm值对应的细胞活力为100 %，计算PK-IFIT3 和PK-EGFP 的细胞活力。

1.6 IFIT3 抗病毒活性的检测 将 PK-IFIT3 和PK-EGFP 以 2×105个 / 孔传代于 24 孔板中，当细胞融合度达到80 %时，感染PRV-TJ 株(MOI=0.1)。感染25 h、30 h 和35 h 后收集上清；采用间接免疫荧光(IFA)和 Reed-Muench 法[9]测定并计算 PRV 的病毒滴度，其中一抗为猪源的PRV 阳性血清(1∶200)，二抗为羊抗猪IgG-FITC (1∶200)。采用本实验室构建的荧光定量PCR (qRT-PCR)检测上述样品中PRV 基因拷贝数[10]，将PAM 按照上述方法传代于24 孔板中，将重组质粒pFUGW-EGFP-IFIT3 和对照质粒pFUGWEGFP 分别与转染试剂按照1∶2 的比例转染。转染24 h 后，感染 PRV-TJ 株(MOI 0.1)。感染 25 h、30 h和35 h 后，收集培养上清，采用同样方法检测上清中PRV 基因组拷贝数和病毒滴度。

1.7 动物感染试验 将6 头仔猪随机分为两组，每组3 头，饲养1 周后，一组肌肉注射1 mL PRV-TJ株(106TCID50/mL)，另外一组肌肉注射1 mL DMEM作为对照组，然后分别在感染后的0、1 d、3 d 和5 d采血，分离其PBMC。

1.8 PAM 和猪PBMC 中IFIT3 转录水平的检测 根据 GenBank 中 登 录 的 猪 IFIT3 cDNA 序 列(NM_001204395.1)利用Primer 5.0 软件设计引物(表1)，采用 TRIzol 法提取 PRV 感染后 6 h 和 14 h 的PAM (MOI 1)和 1.7 获得的猪 PBMC 中的总 RNA，反转录成cDNA 后利用qRT-PCR 检测两种细胞中IFIT3 的 mRNA 转录水平，其中IFN-β 为阳性对照基因，GAPDH 为内参基因。

1.9 细胞凋亡试验 将PK-15 细胞铺于12 孔板中，待细胞融合度达到80 %时分别转染1 μg 的重组质粒 pCMV-HA-IFIT3 和pCMV-HA。转染24 h 后，收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒的说明书进行染色，然后通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.10 统计学方法 本研究使用SPSS 软件对所有实验数据进行Student 氏t检验或方差分析。其中，*：p＜0.05 表示差异显著；**：p＜0.01 表示差异极显著；NS：p＞0.05 表示差异不显著。

2 结 果

2.1 ISGs 重组质粒的表达检测及抗PRV ISGs 的筛选 将过表达质粒pCMV-HA-ISGs (pCMV-HACH25H、pCMV-HA-IFI44L、pCMV-HA-SSBP3、pCMV-HA-ISG15、pCMV-HA-ISG20、pCMV-HA-DD IT4、pCMV-HA-IFIT3、pCMV-HA-GBP1、pCMV-HA-GBP2、pCMV-HA-Mx1)转染 Vero 细胞，经 western blot 鉴定，结果显示各ISGs 均能够正常表达(图1A)。采用与rPRV-EGFP 结合的高内涵筛选系统对抗PRV 的ISGs 进行筛选，通过扫描并计算感染率，评价PRV 的复制情况。结果显示，rPRV-RGFP 感染Vero 细胞后能够形成明显的荧光斑(图1B)，且在Vero 细胞中过表达 IFIT3、ISG15、GBP2、Mx1 和ISG20 及阳性对照均能够显著抑制rPRV-EGFP 复制，其中IFIT3 抑制PRV 复制的效果最显著(p＜0.01)(图1C)，表明 IFIT3、ISG15、GBP2、Mx1 和 ISG20是潜在的抗PRV 的ISGs。

2.2 IFIT3 过表达细胞系的构建与鉴定 将扩增的IFIT3 全长基因克隆至慢病毒载体pFUGW-EGFP，经转染获得的慢病毒感染PK-15 细胞获得稳定表达IFIT3 的细胞系 PK-IFIT3 和稳定表达 EGFP 的 PKEGFP 对照细胞系并经荧光显微镜和western blot 鉴定。结果显示，PK-IFIT3 和PK-EGFP 细胞系均能够观察到绿色荧光(图2A)，且利用EGFP MAb 能够检测到EGFP-IFIT3 融合蛋白的表达(图2B)，表明构建了IFIT3 过表达细胞系。此外，CCK-8 试验结果显示，过表达IFIT3 的PK-IFIT3 细胞其活力与对照PK- EGFP 细胞无显著差异(p＞0.05) (图2C)，表明过表达IFIT3 不影响细胞的活力。

图1 抑制PRV 复制的ISGs 的筛选结果Fig.1 Screening of ISGs that inhibit PRV replication

2.3 IFIT3 抗 PRV 活性的检测结果 用 PRV-TJ 株分别感染 PK-EGFP-IFIT3 和 PK-EGFP 细胞系，经IFA 和qRT-PCR 法检测不同时间收集的细胞培养上清中PRV 的病毒滴度和基因组拷贝数。IFA 结果表明，与PK-EGFP 相比，在感染后25 h，PK-EGFPIFIT3 实验组中PRV 的病毒滴度(图3A)无显著差异(p＞0.05)；在感染后 30 h 和 35 h，PK-EGFP-IFIT3 实验组中 PRV 的病毒滴度(图 3A)显著降低(p＜0.05)。qRT-PCR 结果显示，在感染后25 h、30 h 和35 h，PK-EGFP-IFIT3 实验组中PRV 的基因组拷贝数(图3B)显著降低(p＜0.05)。将 pCMV-HA-IFIT3 和 pCMV-HA 转染PAM，转染 24 h 后感染PRV，在感染后25 h 和 30 h， pFUGW-EGFP-IFIT3 转 染 组 (PAMIFIT3)与 pFUGW-EGFP 对照 转 染 组 (PAM-EGFP)相比，PRV 的病毒滴度(图3C)和基因组拷贝数(图3D)均显著降低(p＜0.05)；而在感染后35 h，与对照组相比，pFUGW-EGFP-IFIT3 转染组中PRV 的病毒滴度(图3C)和基因组拷贝数(图3D)无显著差异(p＞0.05)。以上结果表明IFIT3 是抗PRV ISG。

图2 IFIT3 过表达细胞系的鉴定Fig.2 Detection of IFIT3 overexpressing in the cell line

2.4 PAM 和PBMC 中IFIT3 转录水平的检测 采用qRT-PCR 法检测 PRV-TJ 株感染后的 PAM 中 IFIT3的转录水平。结果显示，PRV-TJ 株感染PAM 后，与对照组相比，IFIT3 和 IFN-β 的 mRNA 转录水平均显著上调(p＜0.01) (图4A 和 4B)；采用同样的方法检测PRV-TJ 株感染后仔猪PBMC 中IFIT3 的mRNA 转录水平。结果显示，与对照组相比，IFIT3 和IFN-β 的 mRNA 转录水平均显著上调(p＜0.05) (图4C)，以上结果表明，PRV 感染在体内体外均能够诱导IFIT3 mRNA 转录水平上调。

图3 IFIT3 抗PRV 活性的检测结果Fig.3 Detection of IFIT3 anti-PRV activity

2.5 过表达IFIT3 对PK-15 细胞凋亡的影响 采用流式细胞术检测过表达IFIT3 对PK-15 细胞凋亡的影响，结果显示过表达IFIT3 组中PK-15 细胞的总凋亡率为 9.5±0.91(%)，对照组为 7.87±1.40(%)，两组中PK-15 细胞的总凋亡率没有显著性差异(p＞0.05)(图5)。表明过表达IFIT3 不影响 PK-15 细胞的凋亡。

3 讨 论

IFIT 家族成员是较早发现的ISGs 分子，在人类基因组中，IFIT 基因位于10 号染色体中，共有4 个成 员 ： IFIT1/ISG56、 IFIT2/ISG54、 IFIT3/ISG60 和IFIT5/ISG58[11]。在猪的基因组中，IFIT 家族同样具有4 个成员，但位于14 号染色体中。IFIT3 能够抑制多种DNA、RNA 病毒的复制，如乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、登革病毒和水疱性口炎病毒等[12-13]。本研究筛选到的猪源IFIT3 能够显著抑制PRV 复制，并证实其是一种抗PRV 的ISG 分子。

图4 PAM 和猪PBMC 中IFIT3 mRNA 转录水平的检测Fig.4 Detection of IFIT3 mRNA transcription level in PAM and PBMC of pigs

图5 PK-15 细胞凋亡率的检测Fig.5 Detection of apoptosis rate of PK-15 cells

通常IFIT 家族分子在大多数细胞中表达量较低，但IFN、病毒感染、外源双链RNA 和脂多糖等刺激可以强烈诱导其表达[14]。本研究中，通过体内和体外试验证实PRV 感染PAM 和猪PBMC 后均可以显著诱导IFIT3 的转录水平，表明IFIT3 与PRV感染相关。

IFIT 家族蛋白具有多个TPR (Tetratricopeptide repeat helix-tum-helix，TPR)结构域，TPR 结构域主要参与蛋白- 蛋白的相互作用，并行使起始翻译、识别双链RNA、参与细胞迁徙及增殖等多种功能。研究显示，IFIT 家族成员与MAVS (Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)、STING 和 TBK1等分子相互作用进而增强IFN 的表达[15]。IFIT3 作为众多ISGs 的一员，是重要的宿主抗病毒免疫效应分子。本研究筛选到的猪源IFIT3 能够显著抑制PRV的复制，并证实PRV 感染猪后，能够显著促进IFIT3 的mRNA 转录水平，然而其抗病毒分子机制尚不明确。研究报道表明IFIT3 能够在体内和体外促进IFN 诱导细胞凋亡[16]，但本研究结果表明猪源IFIT3 不影响PK-15 细胞的凋亡。此外，研究报道IFIT3 通过促进STING 与TBK1 相互作用正向调控RIG-I 通路，加强IRF3 和NF-κB 通路的活化，促进IFN-I 的产生，进而加强细胞的抗病毒作用[17]，这将是猪源IFIT3 抗PRV 机制研究的一个方向。

本研究筛选到5 种潜在的抗PRV ISGs 并证实IFIT3 是一种抗PRV 的ISG，为抗 PRV ISGs 的相关研究，特别是为猪源IFIT3 抗病毒机制的研究奠定了基础，为PR 疫苗的研制提供了新的思路。