鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗与活疫苗免疫鸡病毒载量和免疫效果的比较研究

叶丽娜，李 林，沈 佳，张建伟，史爱华，郑小兰，章振华

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京100097)

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD 病毒(IBDV)引起雏鸡的一种急性、高度接触性传染病，以3 周龄～6 周龄雏鸡最易感。IBDV 感染后导致鸡不同程度甚至长期的免疫抑制，尤其是鸡的体液免疫功能遭到严重破坏[1]，不仅降低了机体对其它病原的抵抗力，还导致其它禽用疫苗免疫效果差或免疫失败，给养禽业造成重大经济损失。预防IBD 的最有效措施是疫苗免疫。目前市售的IBD 疫苗主要是由中等毒力或中等偏强毒力的病毒株制备的，这些疫苗可以突破母源抗体干扰，从而起到很好的免疫效果，但有些病毒株对雏鸡的法氏囊有一定的损伤，尤其中等偏强毒力的病毒株免疫后1 周内雏鸡法氏囊出现明显萎缩，造成一定的免疫抑制[2-4]。针对这一问题，国外研制出了新的疫苗-IBD 免疫复合物疫苗。研究表明，IBD 免疫复合物疫苗不引起鸡法氏囊的明显萎缩，在雏鸡1 日龄～7 日龄免疫时比常规IBD 活疫苗有更好的安全性，可以避免因疫苗早期免疫而引起的免疫抑制。

本实验以IBD 免疫复合物疫苗作为研究对象，并以IBD 活疫苗作对比，免疫1 日龄SPF 鸡后，采用SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测IBD 免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后不同时间鸡法氏囊和PBMC中IBDV 载量，比较病毒在鸡体内开始大量复制的时间是否相同；ELISA 方法和中和试验检测免疫后不同时间血清中IBDV 抗体滴度，并以IBDV 强毒攻毒，比较两种疫苗的免疫效果，为IBD 免疫复合物疫苗的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit购自北京天根生化科技有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit 购 自 Thermo 公司 ；HISTOPAQUER-1077 和HISTOPAQUER-1083 购自 Sigma 公司；IBDV 抗体检测试剂盒购自美国IDEXX 公司。1 日龄SPF 雏鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。作为攻毒用的IBDV BC6/85 株，由中国兽医药品监察所王栋研究员惠赠，毒价为104.0EID50/0.2 mL，攻毒剂量为0.2 mL。IBDV BX 株活疫苗，由本研究室制备。

1.2 IBD 免疫复合物疫苗制备 参照章振华等[6]方法制备IBD 免疫复合物疫苗：以IBDV BX 株活疫苗接种11 日龄SPF 鸡胚后48 h～120 h 收获死亡鸡胚的匀浆液作为抗原；用IBDV BX 株活疫苗免疫27 日龄SPF 雏鸡，连续3 次加强免疫，于第4 次免疫后21 d 心脏采血，分离血清作为制备复合物疫苗用的抗体；固定每羽份疫苗中IBD 抗原中含量为100 EID50，加入适当体积的IBDV 抗血清，混匀后室温中和1 h，配制成抗原抗体复合物疫苗。

1.3 实验设计 将108 只1 日龄SPF 雏鸡随机分成3 组，每组36 只，第1 组和第2 组分别经颈背侧皮下注射IBD 免疫复合物疫苗和IBDV BX 株活疫苗，每只0.1 mL，第3 组鸡不接种疫苗作为空白对照组。3 组分别于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d 随机取6 只SPF 雏鸡，采集其法氏囊和外周血进行后续试验。

1.4 SPF 鸡免疫后IBDV 病毒载量的检测 取免疫后不同时间鸡的法氏囊，按照淋巴细胞分离液1077产品说明书分离法氏囊淋巴细胞，同时取免疫后不同时间鸡的外周抗凝血，按照淋巴细胞分离液1083产品说明书分离PBMC。分别取400 μL 免疫后不同时间浓度为 5×106个 /mL 的法氏囊淋巴细胞和PBMC，参照RNA 提取试剂盒说明书提取淋巴细胞总RNA，反转录为cDNA，以cDNA 为模板，参照朱春华等方法[5]，利用荧光定量RT-PCR 检测IBD免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后不同时间鸡法氏囊和PBMC 中IBDV 的病毒载量。

1.5 免疫鸡外周血中IBDV 抗体滴度的测定 取免疫后不同时间鸡的外周血，分离血清，-20 ℃保存备用。按照IDEXX IBDV 抗体检测试剂盒操作步骤检测免疫后不同时间各组鸡血清中的抗体，并参照章振华等的方法[6]检测该血清中IBDV 中和抗体的滴度。

1.6 攻毒试验 将1 日龄SPF 鸡分为3 组，第1 组和第2 组分别颈背侧皮下注射IBD 免疫复合物疫苗组和IBDV BX 株活苗组，每只0.1 mL，第3 组鸡不接种疫苗作为空白对照组。3 组分别于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d 随机各取 10 只鸡，采用IBDV BC6/85 株经滴鼻点眼及口服途径攻毒，每只0.2 mL。其中滴鼻点眼和口服各0.1 mL。攻毒后72 h 判定各组疫苗对鸡的攻毒保护率。

1.7 数据统计与分析 采用SPASS Statistics17.0 中的Student's t-test 对IBDV 抗体滴度进行差异性分析，数值以“Mean±SE”表示，“**”表示差异极显 著 (p＜0.01)， “ *” 表示差异显著 (p＜0.05)； 以GraphPad Prism 5.0 软件作图。

2 结 果

2.1 鸡法氏囊淋巴细胞中IBDV 病毒载量的检测结果 采用荧光定量RT-PCR 对免疫后不同时间鸡法氏囊淋巴细胞中IBDV 的拷贝数进行定量。结果显示，免疫复合物疫苗免疫SPF 鸡后7 d IBDV 病毒载量还处于极低水平，14 d 后开始迅速升高并达到最高值，之后逐渐下降；活疫苗免疫SPF 鸡后7 d IBDV 病毒载量比免疫后其它时间点均高(图1)。表明免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后IBDV 在法氏囊淋巴细胞中大量复制的时间及复制规律并不相同。

图1 SPF 鸡免疫后法氏囊淋巴细胞中IBDV 病毒载量的检测结果Fig.1 IBDV loads in lymphocytes of bursa of SPF chickens

2.2 鸡PBMC 中IBDV 病毒载量的检测结果 采用荧光定量RT-PCR 对免疫后不同时间PBMC 中IBDV 拷贝数进行定量。结果显示，免疫复合物疫苗免疫SPF 鸡后IBDV 病毒载量先升高，免疫后14 d达到最高，之后下降，免疫后28 d～35 d 检测不到IBDV，42 d 又能检测到；活疫苗免疫SPF 鸡后7 d IBDV 病毒载量比免疫后其它时间点均要高(图2)，与免疫复合物疫苗检测结果类似，IBDV 载量达到最高点后开下降至免疫后28 d～35 d 时检测不到，于42 d 又检测到。表明，复合物疫苗和活疫苗免疫后IBDV 病毒在SPF 鸡PBMC 中大量复制的时间及复制规律并不相同。

图2 免疫鸡PBMC 中IBDV 病毒载量的检测结果Fig.2 IBDV loads in lymphocytes of PBMC of SPF chickens

2.3 鸡血清中IBDV 抗体滴度的检测结果 采用ELISA 抗体检测试剂盒检测两种疫苗免疫鸡血清中IBDV 抗体滴度。结果显示，免疫复合物疫苗免疫后7 d 的鸡血清中未检测到IBDV 抗体，免疫后14 d检测到IBDV 抗体，之后抗体滴度呈升高趋势，于免疫后28 d 达到最高并趋于稳定；活疫苗免疫后7 d的鸡血清中开始检测到IBDV 抗体，之后抗体滴度呈升高趋势，于免疫后21 d 达到峰值，28 d 有所下降，免疫后35 d～42 d 又逐渐升高。活疫苗免疫鸡后7 d 和14 d IBDV 抗体滴度高于免疫复合物疫苗免疫鸡的血清抗体，且差异极显著(p＜0.01)；其它时间均无显著性差异(p＞0.05) (图3)。表明免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后鸡血清中开始产生IBDV 抗体及达到最大抗体滴度的时间并不相同，但抗体滴度在免疫35 d 后渐趋于相同趋势。

图3 免疫鸡血清中IBDV 抗体滴度的检测结果Fig.3 The antibody titer against IBDV in serum

2.4 免疫鸡血清中IBDV 中和抗体滴度的检测结果采用中和试验检测免疫后不同时间鸡血清中的中和抗体滴度。结果显示，免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后7 d 鸡血清中均能够检测到IBDV 中和抗体，且IBDV 中和抗体滴度随免疫时间的延长呈升高趋势，在免疫后42 d 后达到最高，但两个不同疫苗免疫组鸡中和抗体无显著性差异(p＞0.05) (表1) 。表明免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后鸡体内产生IBDV 中和抗体的时间及效价基本相同。

表1 免疫鸡血清中IBDV 中和抗体滴度检测结果Table 1 IBDV neutralization antibody titer in serum after immunization

2.5 攻毒保护试验 将免疫后不同时间点的鸡采用IBDV 强毒株攻毒，计算各组疫苗对免疫鸡的保护率。结果显示，免疫后7 d 攻毒，免疫复合物疫苗和活疫苗对免疫鸡的保护率均为0，其它免疫后不同时间攻毒，保护率均为100 % (表2)。表明免疫复合物疫苗和活疫苗免疫对鸡的保护率相同。

表2 两种IBDV 疫苗对免疫鸡的攻毒保护率Table 2 The protection rates of two IBDV vaccines

3 讨 论

对于免疫复合物疫苗的作用机理，目前仍不是十分清楚。Jeurissens 等认为免疫复合物疫苗的作用机理包括：一是其能够直接与滤泡树突状细胞(FDC)结合并长时间滞留在细胞表面，FDC 不能内化复合物从而保护疫苗中的IBDV 不受淋巴细胞攻击，部分IBDV 被FDC 转运至淋巴结并定居，在淋巴结内诱导产生更多的生发中心，使得IBDV 复制、增殖效率更高。二是免疫复合物疫苗中的抗体分子的Fc 片段与APC 的Fc 受体亲和性高，疫苗中的IBDV 能够更有效的结合APC，复合物被APC 吞噬后其中的病毒并没有被杀灭，病毒在APC 内复制并激活T、B 淋巴细胞，从而引起更强烈的体液免疫和细胞免疫应答[7-8]。本实验以免疫复合物疫苗免疫1 日龄SPF 鸡，于免疫后不同时间取鸡法氏囊和外周血，荧光定量PCR 检测法氏囊淋巴细胞和PBMC中IBDV 载量，并与BX 活疫苗免疫的SPF 鸡作对比，结果显示活疫苗免疫后7 d 鸡法氏囊和PBMC中IBDV 的病毒载量最高；而免疫复合物疫苗免疫后14 d 时鸡法氏囊和PBMC 中IBDV 的病毒载量达到最高，表明免疫复合物疫苗和活疫苗免疫鸡体内病毒载量变化规律并不相同，前者中的IBDV 在鸡法氏囊和外周血中大量复制、增殖的时间比活疫苗的推迟7 d 左右，原因在于免疫复合物疫苗中的IBDV 刚进入机体时受到了保护，使得IBDV 在机体内停留一段时间后才开始大量复制、增殖，且复制、增殖效率高于活疫苗，实验结果也进一步证实了Jeurissens 等对于免疫复合物疫苗作用机理的推测。此外，雏鸡在3 日龄～9 日龄时法氏囊中的B 淋巴细胞处于快速发育成熟期，之后渐渐趋于平稳[9]，即使免疫复合物疫苗中的IBDV 于免疫后14 d 左右在法氏囊中大量复制、增殖，此时法氏囊中的B 淋巴细胞已发育成熟并趋于稳定，因此免疫复合物疫苗中的IBDV 对法氏囊中B 淋巴细胞的损伤程度也将很大程度低于活疫苗。也正是因为前者中的IBDV在法氏囊中大量复制、增殖的时间比活疫苗迟7 d左右，因此可以有效避免疫苗免疫雏鸡后的法氏囊严重萎缩而引起的免疫抑制。本实验中活疫苗免疫14 d 后法氏囊淋巴细胞中仅检测到含量非常低的IBDV，原因可能是活疫苗为中等强毒力病毒株，免疫后7 d 法氏囊出现水肿病变，免疫后14 d 法氏囊已经严重萎缩，法氏囊内的淋巴细胞大部分凋亡或死亡，病毒无法在囊内大量增殖，法氏囊还没有恢复促进淋巴细胞发育的能力，21 d 后法氏囊损伤期过后，恢复了一定的促进淋巴细胞发育的能力。

IBDV 侵入机体后主要由B 淋巴细胞介导的体液免疫发挥作用[10]。体液免疫水平的高低和攻毒保护试验可以作为评判疫苗免疫效果的一种方法。本研究采用ELISA 方法检测活疫苗免疫7 d 和14 d 时鸡血清中IBDV 抗体水平比免疫复合物疫苗的高，且差异显著(p＜0.01)，但中和试验结果显示两种疫苗IBDV 中和抗体水平及升高趋势基本相同，且攻毒试验显示两种疫苗的保护率相同，表明两种疫苗的免疫效果相同，这种差异性可能是由于ELISA 试剂盒和中和试验能够检测到的抗体不同导致，ELISA 方法所检测的抗体并不都是中和抗体。同时采用ELISA 和中和试验测定免疫鸡血清中IBDV 抗体水平，使得实验数据更加准确。免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后42 d，ELISA 检测结果显示IBDV抗体滴度均处于较高点，但此时PBMC 中病毒载量也显著增高，具体原因有待进一步分析。

对于免疫复合物疫苗的研究，目前国内还处于起步阶段，王雅华等用传染性喉气管炎病毒K317株与传染性喉气管炎抗体按一定比例配制成抗原抗体复合物疫苗，免疫1 周龄SPF 雏鸡，结果复合物疫苗安全性高，免疫效果较ITLK317 常规活疫苗好[11]；刘成倩等用鸡新城疫抗原抗体免疫复合物疫苗和鸡新城疫灭活疫苗免疫鸡，结果复合物疫苗免疫鸡后血清中HI 抗体效价高于灭活苗免疫的，表明复活物疫苗免疫效果较灭活疫苗好[12]；叶丽娜等分别取IBDV 免疫复合物疫苗和活疫苗免疫后7 d～42 d 鸡的外周血血清，ELISA 方法测定血清中NF-κB 水平，结果显示，活疫苗免疫后鸡血清中NF-κB 显著高于免疫复合物疫苗，而后者与对照组鸡的基本相同，而NF-κB 作为细胞内的一种转录因子，参与免疫应答、炎症反应、细胞凋亡等生理病理过程[13]。活疫苗免疫引起NF-κB 水平的升高，提示活疫苗可能会引起法氏囊的炎症和细胞凋亡。以上研究结果显示，免疫复合物疫苗较传统的活疫苗、灭活苗免疫效果更佳，研究具有一定的意义。

研究结果也表明，免疫复合物疫苗和活疫苗免疫效果基本相同，但从法氏囊淋巴细胞中IBDV 病毒载量测定结果显示，活疫苗免疫7 d 左右IBDV在法氏囊淋巴细胞中已经开始大量增殖，使法氏囊淋巴细胞遭到破坏，引起机体免疫抑制；免疫复合物疫苗免疫鸡14 d 左右IBDV 才开始在其法氏囊淋巴细胞中大量增殖，此时法氏囊淋巴细胞已基本发育成熟并趋于稳定，避免了对免疫鸡的免疫抑制，较活疫苗更安全。实验结果为IBD 免疫复合物疫苗的研发提供了参考依据。