KDM4A调控肝癌细胞增殖机制*

孙黎，戴宇翃，邹曼，邱红

(华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科，武汉 430030)

组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM4家族包括KDM4A-D，在调节染色质结构、基因转录及细胞分化中起重要作用。其中对KDM4A/JMJD2A的研究最为深入。目前已知KDM4A的催化酶作用包括H3K9、H3K36、H1.4K26位点的去甲基化[1]。研究发现，KDM4A除催化酶功能之外，还可以与多种转录因子及受体结合并影响细胞增殖，而这种功能可能并不依赖于催化酶活性[2]。研究显示，KDM4A表达水平与肝癌预后密切相关，肿瘤组织高表达KDM4A的患者较低表达组生存率明显下降。因此，本研究拟分析KDM4A基因表达对肝癌细胞增殖的影响及其作用机制，以期为肝癌的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1细胞系和材料 Hep3B细胞、293T细胞由华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中心传代培养。慢病毒包装质粒和Myr-AKT质粒由美国Wake Forest大学Hui-Kuan Lin教授惠赠，KDM4A shRNA序列慢病毒载体购自Sigma公司(批号：TRCN0000013496，TRCN0000013497)。抗体均购自Santa Cruz公司，包括：-Actin抗体(sc-47778)，KDM4A抗体(sc-81302)， AKT抗体(sc-5298)，P-Akt T308抗体(sc-135650)，GSK-3b抗体(sc-377213)，P- GSK-3b ser9抗体(sc-11757)，HA抗体(sc-7392)。

1.2慢病毒的包装 常规培养293T细胞，转染包装质粒、衣壳质粒、表达质粒三质粒系统。转染后48～72 h收取含病毒的上清液，经孔径0.45 μm过滤器过滤备用。

1.3细胞的感染 常规培养Hep3B细胞，感染上述制备的慢病毒。添加感染增强剂Polybrene，保证终浓度为 8 μg·mL-1。病毒感染12 h后，观察细胞状态。病毒感染细胞 72 h 后，荧光显微镜下观察细胞，评估慢病毒感染目的细胞的效率。加入2 μg·mL-1Puromycin筛选。

1.4平板克隆形成实验 取对数生长期各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，将细胞悬浮在10%胎牛血清DMEM培养液备用。……