乙肝病毒基因分型与原发性肝癌关系研究

王超　林松斌　许天奖　尹毅锐

【摘要】 目的：研究乙型肝炎病毒（HBV）基因分型及其与原发性肝癌的关系。方法：回顾性收集复旦大学附属中山医院2015年1月1日-12月31日符合入组条件的慢性乙型病毒性肝炎患者，按照是否合并肝癌分为肝癌组（182例）与非肝癌组（189例），通过留取血清来完善乙型肝炎病毒基因分型及相关耐药性检测。结果：371例乙肝患者，其中B型95例，C型患者276例;肝癌患者较非肝癌乙肝人群中HBV C型较B型所占比例显著高（字2=6.366，P=0.012），肝癌患者中HBV C型较B型突变比率（耐药性）显著高（字2=6.777，P=0.009）。结论：相较乙肝人群中，HBV C型在乙肝相关的肝癌患者中占有更高的比例和突变率;相较B型也有更高的突变率;提示HBV C型突变型在肝癌发生中可能存在一定的作用。

【关键词】 HBV基因分型; 原发性肝癌; 耐药性

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.08.002 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）08-000-03

A Research on the Relationship between Hepatitis B Virus Genotyping and Primary Carcinoma of Liver/WANG Chao，LIN Songbin，XU Tianjiang，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（8）：-5

【Abstract】 Objective：To study the genotyping of hepatitis B virus（HBV） and its relationship with primary carcinoma of liver.Method：Retrospectively collected affiliated Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University on January 1，2015 and December 31，2015，complied with the conditions set of chronic hepatitis B patients with viral hepatitis，according to whether the merger of liver cancer divided into cancer group（182 cases） and non-cancer group（189 cases），through to return to improve serum hepatitis B virus genotyping and related drug resistance test.Result：There were 371 patients with hepatitis B，including 95 patients with type B and 276 patients with type C.The proportion of HBV type C in cancer patients was significantly higher than that of non-cancer patients

（字2=6.366，P=0.012），and the mutation（drug resistance） rate of HBV type C in cancer patients was significantly higher than that of type B （字2=6.777，P=0.009）.Conclusion：Compared with hepatitis B patients，HBV type C has a higher proportion and mutation rate in HBV-related liver cancer patients.It also has a higher mutation rate than type B.It suggests that HBV C type mutation may play a role in the occurrence of primary carcinoma of liver.

【Key words】 Hepatitis B virus gene type; Primary carcinoma of liver; Drug resistance

First-authors address：Xiamen Branch Zhongshan Hospital of Fudan University，Xiamen 361015，China

慢性乙型病毒型肝炎（HBV）是由乙型肝炎病毒所致的肝臟炎症性疾病，历经1965-1979年国外相关学者研究发现后正式予以命名，因其在全世界范围流行，在中国更是病毒性肝炎的常见病因[1]。据调查，目前全世界大约20亿人感染过HBV，最终有3.5亿人发展为慢性乙型肝炎感染者[2]，而在这当中中国则以60岁以下发病为主。HBV的基因型不同，不同基因型的临床和病理特征也不同。原发性肝癌是中国常见恶性肿瘤死亡的第三大原因，严重威胁着我国人民的生命和健康。在这当中以肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）多见，占85%～90%。在中国，HCC的发生率占世界的55%，约90%为乙肝肝炎相关的肝癌[3]。研究表明，长期的慢性乙型病毒复制没有控制，后期容易渐渐并发肝硬化甚至肝癌的发生。不同类型的HBV可能与HBV突变有关，因此本回顾性研究旨在探讨HBV基因分型与原发性肝癌之间可能存在的关系，从而更好予以临床指导和规范治疗作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月1日-12月31日，于复旦大学附属中山医院完善血清乙型肝炎病毒五项检测的患者，纳入标准根据文献[4]中华医学会肝病科和传染病科的“慢性乙型肝炎防治指南”的修订，诊断标准分类。排除标准：其他肝脏相关病毒（甲型、丙型、丁型、戊型肝炎）的重叠感染;由脂肪、酒精、药物、自身免疫等其他因素引起的各类肝脏损伤;合并原发性肝癌除外的其他恶性肿瘤病史。共有371例患者符合条件入组，按照是否合并肝癌分为肝癌组（182例）与非肝癌组（189例），通过留取血清来完善乙型肝炎病毒基因分型及相关耐药性检测。

1.2 仪器与试剂

测定乙型肝炎病毒基因分型及相关耐药性检测仪器分别为Roche Light Cycler480荧光定量PCR仪，Roche公司生产;ABI3130基因测序仪，美国应用生物系统公司（ABI）生产。试剂盒是由上海申友生物技术有限责任公司提供（产品货号：YZB/国0080-2009）。

1.3 方法

通过PCR扩增技术结合荧光探针杂交技术对乙型肝炎病毒DNA进行检测，并根据其产物通过测序分析来达到完成基因分型及耐药突变点的检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0对肝癌组及非肝癌组所测的基因各分型及耐药性结果进行分析，率的比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

在符合入组条件的两组人群371例中，男285例及女86例，平均年龄（49.95±13.65）岁。

2.2 分型情况

在肝癌组中182例中，乙肝基因分型B型36例，乙肝基因分型C型146例;在非肝癌组189例中，乙肝基因分型B型59例，乙肝基因分型C型130例。在肝癌组中182例中，乙肝基因野生型67例，乙肝基因突变型（耐药型）115例;在非肝癌组189例中，乙肝基因野生型105例，乙肝基因突变型（耐药型）84例。肝癌患者较非肝癌乙肝人群中HBV C型较B型所占比例显著高，差异有统计学意义（字2=6.366，P=0.012），见表1。肝癌患者较非肝癌乙肝人群中HBV突变型（耐药型）所占比例显著高，差异有统计学意义（字2=13.097，P<0.001），见表2。

2.3 不同分型的耐药性

HBV B型在肝癌患者较非肝癌乙肝人群比较中突变型（耐药型）所占比例差异无统计学意义（字2=1.889，P=0.169），见表3。

HBV C型在肝癌患者较非肝癌乙肝人群比较中突变型（耐药型）所占比例显著高，差异有统计学意义（字2=8.304，P=0.004），见表4。

在肝癌组患者中的HBV C型較B型突变比率（耐药性）显著高，差异有统计学意义（字2=6.777，P=0.009），见表5。

3 讨论

慢性乙型病毒性肝炎是我国最常见的病毒性肝炎及肝功能异常的病因之一，新中国成立以来的广泛流行及在人群中受累均受到国内学者的关注;中国是HBV感染的高危地区，有近1亿HBV携带者，其中20%～30%患有肝硬化和肝癌等严重疾病，且呈逐年递增趋势[5]。对HBV的研究中，历经1965-1979年国外相关学者研究发现后正式予以命名，直至1988年国外学者才首次报道HBV基因分型，不同的毒株长期与环境间的突变进化，导致了A-H等8种分型[6-7]，近年来有文献[8-9]显示另有新的亚型I、J2型出现，但还存在着争议。据研究发现，HBV基因型的分布存在种族和地理差异，A型更多地分布在欧洲和中非地域;亚洲的主要流行病型是B和C型;具体到中国的情况则是南部有多种B型，北部有C型，另外我国亦存在极少见的A型基因型存在[10]。不同基因型的流行病学和临床特征也不同，与肝脏病变程度和药物治疗效果有一定的相关性[11]，影响着疾病的预后及病情的转归。在这项回顾性研究中，目前就诊患者的基因型仍然主要是B和C。其中C型占优势，这一点与之前研究基本相仿，但因笔者所在医院患者就诊特殊性，具体南北或江浙一带分型趋势，无法较前比较造成了数据差异。

原发性肝癌也是世界范围内常见的恶性肿瘤，其发病隐匿，在起病早期缺乏相关典型的临床症状。其发病凶险，中位生存期短，晚期治疗效果欠佳为重要特征。而在我国更是高发，据文献[12]统计，截至2016年，我国的原发性肝癌已占据全球的55%，发病率及死亡率继续每年递增，也是我国因肿瘤死亡的第三位，仅仅次于胃癌、肺癌[13]。原发性肝癌的危险因素受多种因素、多因素和多种途径的影响。然而，慢性病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎，在肝癌的发生中起重要作用。在西方发达国家中，与原发性肝癌发生相关的肝炎，乙肝、丙肝均有，我国是乙肝大国，中国肝癌发病率高与慢性乙型肝炎的发病有很大关系。有研究报道乙型肝炎病毒载量和活跃复制与原发性肝癌的发生密切相关[14]。乙型肝炎病毒中的X蛋白直接激活原癌基因并使肿瘤抑制基因p53和p16失活。另一方面乙肝病毒复制活跃早期也通过损伤正常的肝细胞、炎症进展从而促进肝脏肿瘤发生，特别是HBeAg也会帮助乙肝病毒避开免疫系统及作为靶抗原诱导免疫细胞攻击被感染的肝细胞促进这一过程;而乙肝病毒的耐药和突变会通过调控pg RNA转录，导致HBV基因组复制及加速肿瘤发生率[15]，本回顾性研究中的肝癌患者较非肝癌乙肝在人群中HBV突变型（耐药型）所占比例显著高（P<0.001），也恰好验证了这一观点。虽然病毒突变对肝癌的发生存在作用，但是在本研究中，B型患者在肝癌患者较非肝癌乙肝人群比较中突变型（耐药型）所占比例差异无统计学意义（P>0.05），表明了乙肝基因分型B型患者可能在其耐药菌株的突变变异对肝脏肿瘤的发生无明显作用，国内外文献目前鲜见关于此方面的报道，亦有可能与个体差异及样本量不大存在相关。乙型肝炎病毒基因分型C型患者，在本研究中，在肝癌患者较非肝癌乙肝人群比较中突变型（耐药型）所占比例显著高（P=0.004），且在肝癌人群中较B型的突变比率（耐药性）也是显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），这表明在乙型肝炎进展为肝癌的过程中，C型基因的发病率较高。这点与国内学者文献[16-17]报道研究是一致的。研究表明，B型患者较C型患者的HBeAg阳性低、血清转换高，从而发生肝癌的风险会低于C型基因[18]，这可能导致B和C基因型差异的存在，本文未做深一步地探讨。近年来国内学者司书梅等[19]的meta分析也验证了这一观点，且C型基因会较B型基因更容易引起耐药突变及多基因点突变[20]，从而引发免疫逃逸最终增加肿瘤发生。

综上所述，本研究总结了乙肝基因型与肝癌的相关性研究，相较乙肝人群中，HBV C型在乙肝相关的肝癌患者中占有更高的比例和突变率;相较B型也有更高的突变率;提示HBV C型突变型在肝癌发生中可能存在一定的作用，但仍需进一步完善关于乙肝及肝癌的临床资料，必要时扩充病例数，并积极参与乙肝病毒全外显子测序结果分析，进一步发掘研究的不同方向;另一方面，乙肝病毒的耐药性，特别是未用过核苷酸类似物药物患者具有耐药性及发生多重耐药现象预示着乙肝基因耐药性在肝病进展研究中的重要性。研究还表明，积极有效抗病毒治疗可以减轻病毒复制，减少对肝脏的损害，从而降低肝癌的发病率[21]，故临床上可以根据乙肝基因分型及耐药突变合理诊断及选择合适抗病毒治疗方案加以干预，从而降低肝癌及终末期肝病的发生率，为慢乙肝患者提供较好的预后。

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