羟尼酮治疗四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的实验研究

肝纤维化是指由各种致病因子所致的肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质(ECM)过度沉积的病理过程。它不是一种独立的疾病，许多因素均可引起肝纤维化，包括乙醇、病毒性肝炎、药物、毒素、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性疾病和代谢紊乱等[1]。肝纤维化是所有慢性肝病的共同病理基础，由ECM合成和降解失衡导致ECM过度沉积所致，可能发展为肝硬化、肝细胞癌，甚至引起患者死亡[2]，随着其病死率不断升高，肝纤维化已成为全球性健康问题[3-4]。然而，越来越多的证据表明肝纤维化是动态的，是可以逆转的[5]，但目前尚无有效治疗人肝纤维化的方法。

近年来，吡非尼酮(F647)已被批准为治疗特发性肺纤维化的新型药物[6]，其衍生物PBD-617在动物实验中被证实有抗肺纤维化作用，其作用机制为抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)信号[7]，亦有不少研究表明F647具有抑制心、肾、肝等纤维化的作用[8]。本文研究F647的同分异构体羟尼酮(F351)对四氯化碳(CCl4)诱导小鼠肝纤维化的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备

6周龄BALB/c雄性小鼠(购自上海市西普尔-必凯实验动物有限公司)104只，平均体质量20～25 g，分笼饲养于SPF级动物房中，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%。在动物房适应2 d后将小鼠随机分为正常对照组6只，造模组98只。造模3周后，生存小鼠按随机数表法进行分组：模型3周组6只，模型组12只，利加隆组10只，F351-100 mg/kg组10只，F351-30 mg/kg组10只，F351-10 mg/kg组10只，F351-3 mg/kg组10只，F351-1 mg/kg组10只，F647-100 mg/kg组10只，F647-30 mg/kg组10只。20% CCl4橄榄油溶液(0.5 mL/100g，其中CCl4购自苏州三杰化学品有限公司，分析纯；橄榄油购自上海嘉里食品工业有限公司)腹腔注射给药，每日1次，维持7周，诱导肝纤维化模型。自第3周后，F351、F647、利加隆(F351及F647均由上海睿星基因技术有限公司提供，利加隆购自德国马博士大药厂)各组根据小鼠质量配制成相应质量浓度的液体(10 mL/kg)，通过灌胃给药，每日1次，共4周。其中模型3周组在第3周末取材观察肝组织纤维化程度，以提供用药前模型病理资料。末次给药结束后次日，心脏取血，分离血清；定位留取肝组织，10%福尔马林固定；定位留取肝组织于-70℃冷藏备检。

1.2 血清肝功能检测

小鼠取血后室温静置1 h，应用低温高速离心机(Beckman CS-15R型)以3 000 r/min离心15 min，分离血清，用血清自动生物化学检测仪(Olympus公司)检测血清肝功能，包括总胆红素(TBIL)、间接胆红素(IBIL)、直接胆红素(DBIL)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总蛋白(TP)及白球比(A/G)。

1.3 肝组织羟脯氨酸检测

严格按照羟脯氨酸试剂盒(羟脯氨酸试剂盒购自南京建成科技有限公司)完成肝组织羟脯氨酸检测，原理为羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲酸作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。

1.4 肝组织中TGF-β1及α-SMA表达的检测

石蜡切片经苏木精-伊红(HE)染色，镜下观察组织病变并进行GS分级，肝纤维化程度S0-S4期判定标准：S0，汇管区无肝纤维化；S1，汇管区纤维化扩大，局限窦周及小叶内纤维化；S2，汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留；S3，纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；S4，早期肝硬化。免疫组织化学检测观察TGF-β1及α-SMA的表达，通用型二抗购自长岛生物科技有限公司，兔抗人TGF-β单克隆抗体一抗及鼠抗人α-SMA单克隆抗体一抗均购自Bioworld生物科技有限公司，免疫组织化学试剂盒(ABC法)购自深圳晶美生物工程有限公司。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠的死亡情况和体质量、肝脏质量

每次CCl4造模前(每周一、周四)各组小鼠称重，造模及给药过程中观察小鼠的生长情况，统计存活及死亡数量。7周末各组小鼠心脏取血，留取肝组织，并称量肝脏质量。见表1。

表1 各组小鼠存活、死亡情况和体质量、肝脏质量

2.2 各组血清肝功能情况

与正常对照组相比，7周造模组血清ALT、AST水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，F351各组的ALT、AST水平均较7周造模组下降，但并无统计学差异；7周造模组的血清TBIL、IBIL、DBIL水平较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，F351各组较7周造模组均下降，但并无统计学差异。详见表2。

2.3 各组的羟脯氨酸含量

与正常对照组相比，7周造模组羟脯氨酸含量明显升高，F351-100 mg、F351-30 mg、F647-100 mg、F647-30 mg及利加隆组的羟脯氨酸含量较7周造模组下降，且P<0.05。见表3。

表2 各组的血清肝功能情况

表3 各组肝组织羟脯氨酸含量

注：与7周造模组相比，aP<0.05

2.4 肝组织病理学观察结果

对肝组织切片进行HE染色及Masson染色，光镜下观察其病理改变，可见7周造模组与正常组相比，纤维条索增多，假小叶形成，F351-100 mg治疗组小鼠肝组织显示肝小叶结构的破坏得到修复。见图1、图2。根据Scheuer评分方法，对各组标本肝纤维化分期进行阅片计分统计，结果见表4。

与7周造模组相比，F351-100 mg、F351-30 mg、F647-100 mg、 F647-30 mg及利加隆组的纤维化程度均有所减轻；观察F351组间量效关系可知，F351-30 mg/kg剂量开始有显著好转趋势，且F351-100 mg/kg更优于F351-30 mg/kg，并且均优于F647等剂量效果。见图3。

图1 肝组织HE染色 ×100A正常对照组B7周造模组CF351-100 mg组

图2 肝组织Masson染色 ×100A正常对照组B7周造模组CF351-100 mg组

表4 各组肝纤维化的分期结果/例

注：“—”表示无数据。与7周造模组相比，aP<0.05

图3 各组肝纤维化评分柱状图

2.5 免疫组织化学方法检测肝组织中TGF-β1及α-SMA的结果

与正常组相比，7周造模组肝组织TGF-β1 及α-SMA表达升高，F351-100 mg组与造模组相比则表达降低。见图4、图5。

图4 免疫组织化学方法检测肝组织中TGF-β1的表达 ×100A正常对照组B7周造模组CF351-100 mg组

图5 免疫组织化学方法检测肝组织中α-SMA的表达 ×100A正常对照组B7周造模组CF351-100 mg组

3 讨论

肝纤维化由各种慢性肝病进展所致，虽然肝脏有强大的再生能力，但是慢性持续的损伤性刺激终将导致肝纤维化[9-11]。目前肝纤维化已成为全球性健康问题，其以胶原纤维过量沉积及肝星状细胞(HSC)活化为特征[12-15]，在正常肝脏中，HSC维持着非增殖和静止的表型，然而在肝损伤时，HSC被激活[16]，在肝纤维化过程中起着重要的作用[17]。HSC的活化和增殖，将在肝纤维化发病过程中产生ECM蛋白，包括Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA，这些蛋白质被认为是纤维化的标志物，参与了一系列的炎性反应和纤维化过程[18]。多种细胞因子参与了肝纤维化过程，TGF-β1在肝纤维化进程中被认为是目前众多细胞因子中最重要的一种[19]，其在急慢性肝损伤后由库普弗细胞、窦内皮细胞和血小板分泌[20]，可通过激活静止的HSC促进新基质成分的合成；另一方面，可通过增加金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)等酶的合成，抑制ECM的降解[21]。星状细胞是ECM的主要产生细胞，抑制HSC活化可成为治疗肝纤维化的重要措施[12-14]。

CCl4诱导的肝纤维化在形态学上与人肝纤维化相似，因此被广泛应用于肝纤维化模型的建立[22]。本实验中CCl4造模成功后，7周造模组血清ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL及肝组织羟脯氨酸含量较正常对照组显著增加，而F351各组上述指标较7周造模组均降低。这些结果表明F351对CCl4所致小鼠慢性肝损伤有治疗作用。肝组织病理观察纤维化程度可知，F351-30 mg/kg剂量开始对CCl4所致小鼠肝纤维化有显著治疗作用，且F351-100 mg/kg的效果优于F351-30 mg/kg。各种原因所致的慢性肝损伤均可导致HSC活化，活化的星状细胞是ECM的主要来源。活化的HSC可表达TGF-β及α-SMA，因此α-SMA增多提示HSC活化，其是肝纤维化的标志物[23]。TGF-β是目前已知最强烈的纤维化促进因子。本实验中免疫组织化学结果显示，7周造模组的TGF-β1及α-SMA表达水平较正常组升高，各用药组尤其是F351-100 mg组的TGF-β1及α-SMA表达水平比7周造模组显著降低。因此，F351可能通过抑制HSC活化及抑制TGF-β经典信号通路达到抗纤维化的作用。

综上所述，F351对CCl4诱导的小鼠肝纤维化有治疗作用，其作用机理可能与肝细胞保护及抑制HSC活化、减少TGF-β1的表达有关。