血管内皮生长因子-A和α-Adducin在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的相关性

胃癌(GC)是全球范围内发病率和病死率较高的一种恶性肿瘤，近年来发病率逐年升高，患者呈年轻化趋势[1-2]。淋巴结转移是GC患者术后复发的主要因素之一，严重影响患者的预后。因此，对影响GC预后的相关因素分析具有重要的临床意义。研究表明，血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、细胞膜骨架蛋白α-Adducin(ADD1)在宫颈癌、原发性胆囊癌、食管鳞状细胞癌等恶性肿瘤中有异常表达，并与这些肿瘤的发生和侵袭转移有关[3-5]。目前对于VEGF-A和ADD1在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征及预后的相关性的研究较少。本研究通过检测VEGF-A、ADD1在GC组织和癌旁正常组织中的表达水平，分析VEGF-A、ADD1在GC组织中的表达水平与临床病理特征及预后的关系，并探讨VEGF-A和ADD1之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2010年5月至2012年5月浙江省台州医院确诊的147例GC患者的肿瘤组织，以及距肿瘤组织>1.5 cm的正常组织作为研究组和对照组。入选标准：(1)经病理学检查确诊为GC，肿瘤组织及癌旁正常组织为面积约2 cm×1.5 cm，厚度约0.3 cm的组织块；(2)术前未经任何治疗；(3)所有研究对象随访资料完整。排除标准：(1)合并有其他恶性肿瘤或其他严重疾病；(2)不能耐受本研究的治疗；(3)依从性不佳，不能定期随访。本研究经本院伦理委员会批准。

147例患者中，男性123例，女性24例；年龄29～81岁，中位年龄为55岁，年龄≤55岁有70例，年龄>55岁有77例；肿瘤位置：上部61例，中部32例，下部51例，全胃3例；病理分化程度：中低分化113 例，高分化34例。所有患者及家属对本研究充分知情，并签署知情同意。

1.2 免疫组织化学方法

采用10%中性甲醛溶液(南京化学试剂股份有限公司)对所有标本进行固定，乙醇(武汉梯度科技有限公司)梯度脱水，用石蜡包埋成块，切成4 μm连续切片，二甲苯(苏州百腾科技有限公司)脱蜡，柠檬酸盐缓冲液(广州威佳科技有限公司)抗原修复，PBS磷酸缓冲液(西安嘉博盈生物科技有限公司)漂洗，内源性过氧化物酶灭活，加山羊血清(上海恒远生物科技有限公司)封闭，滴加稀释比例为1∶200的兔抗人VEGF-A多克隆抗体(上海安妍生物科技有限公司)和稀释比例为1∶300的兔抗人ADD1多克隆抗体(上海孟成科技有限公司)，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗，滴加稀释比例为1∶400的羊抗鼠IgG(广州雷神生物科技有限公司)，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗，使用DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)进行显色5 min，PBS终止反应，苏木精(北京索莱宝科技有限公司)复染，脱水，中性树脂封片剂(上海浩洋生物科技有限公司)封固，显微镜(成都英度科技有限公司)观察VEGF-A、ADD1的表达。

1.3 判定标准

由两名具有执业资格的病理科医生采用双盲法对结果进行判断和分析，通过双评半定量法对结果进行评定。染色强度：黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性百分率：阳性细胞率≤5%计0分，阳性细胞率6%～25%计1分，阳性细胞率26%～50%计2分，阳性细胞率51%～75%计3分，阳性细胞率≥76%计4分。两项评分之积为判定标准：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)[6-7]。本研究将阴性、弱阳性判定为低表达，阳性、强阳性判定为高表达。

1.4 随访方式

采用电话回访和实地走访相结合的方法定期随访，对患者术后的生活状况进行记录。术后第1天随访至2017年5月，前3年1个季度随访1次；第4～5年半年随访1次。随访内容包括临床检查、CT平扫、胃镜检查等。

1.5 观察指标

观察VEGF-A、ADD1在GC组织和癌旁正常组织中的表达水平，VEGF-A、ADD1表达水平与GC患者临床病理参数的关系，VEGF-A、ADD1表达水平与患者预后的关系，VEGF-A、ADD1在GC组织表达的相关性。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。计数资料以率(%)表示，采用卡方检验；等级资料采用秩和检验，VEGF-A、ADD1高表达组和低表达组GC患者的总生存率(OS)、无病生存率(DFS)分析采用Kaplan-Meier生存分析法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF-A、ADD1在GC组织和癌旁正常组织中的表达水平

免疫组织化学染色结果显示，VEGF-A主要定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒；ADD1主要定位于细胞质，呈棕褐色颗粒(见图1)。VEGF-A在GC组织和癌旁正常组织中的高表达率分别为49.66%(73/147)和13.61%(20/147)，GC组织中VEGF-A高表达率显著高于癌旁正常组织(P<0.05)；ADD1在GC组织和癌旁正常组织中高表达率分别为63.95%(94/147)和17.01%(25/147)，GC组织中ADD1高表达率显著高于癌旁正常组织(P<0.05)。见表1。

图1VEGF-A、ADD1在GC组织和癌旁正常组织中的免疫组织化学染色AVEGF-A在GC组织中的阳性表达 ×200BVEGF-A在癌旁正常组织中的阴性表达 ×200CADD1在GC组织中的阳性表达 ×400DADD1在癌旁正常组织中的阴性表达 ×400

表1 VEGF-A、ADD1在GC组织和癌旁正常组织中的表达水平比较/例

注：“—”表示无数据

2.2 VEGF-A表达与GC患者各临床病理参数之间的关系

在肿瘤位置不同的GC患者中VEGF-A表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，而性别、淋巴结转移、年龄、浸润深度、组织分化程度、TNM分期不同的GC患者中VEGF-A表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 ADD1表达与GC患者各临床病理参数之间的关系

组织分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移不同的GC患者中ADD1表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，而性别、年龄、肿瘤位置不同的GC患者中ADD1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 VEGF-A、ADD1在GC组织中的相关性分析

VEGF-A、ADD1在GC组织中的表达呈正相关(r=0.236，P=0.004)，见表4。

2.5 VEGF-A、ADD1高表达组和低表达组GC患者的OS、DFS的Kaplan-Meier分析

在147例GC患者中，VEGF-A高表达组OS及DFS显著低于VEGF-A低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)；ADD1高表达组OS及DFS显著低于ADD1低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、图3。

表2 VEGF-A表达与GC患者各临床病理参数之间的关系

表3 ADD1表达与GC患者各临床病理参数之间的关系

表4 VEGF-A、ADD1在GC组织中的相关性分析/例

图2 VEGF-A在GC患者中的生存分析ADFSBOS

3 讨论

GC是发生于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在中国其发病率居恶性肿瘤之首，临床症状常表现为恶心、呕吐、消瘦、上腹疼痛等，主要由环境、饮食习惯、细菌感染等因素所致[8-10]。GC的早期症状不明显，治疗方法单一，预后评估不良。因此，研究GC的发生发展机制对于GC的诊断和治疗具有重要意义。

图3 ADD1在GC患者中的生存分析ADFSBOS

血管生成是肿瘤发生、发展及转移的基础，由体内多种血管生成刺激因子和血管生成抑制因子共同调控，血管生成刺激因子主要包括血管生成素、血小板来源的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、VEGF等。其中，VEGF作为单一基因编码的同源二聚体糖蛋白，促血管生成的作用较强且特异性较高，其与内皮细胞上的两种受体KDR、Flt-1结合后，可促进血管内皮细胞增殖，并诱导其迁移；同时还可提高血管通透性，引起纤维蛋白原等血浆蛋白外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。VEGF-A是VEGF家族的重要成员，对肿瘤发生发展及血管生成具有重要作用。李华伟等[11]发现，VEGF-A在肝细胞癌中的表达明显升高。王颖等[5]研究显示，VEGF-A表达在研究食管鳞状细胞癌(ESCC)淋巴结转移方面具有一定的应用价值，可以作为评价预后的有效指标。本研究中，GC组织中VEGF-A高表达率显著高于癌旁正常组织，提示VEGF-A参与GC的发生，这与李君强等[12]的研究结果一致。肿瘤位置不同的GC患者中VEGF-A表达水平差异显著，而性别、淋巴结转移、年龄、浸润深度、组织分化程度、TNM分期不同的GC患者中VEGF-A表达水平差异不显著，提示VEGF-A表达水平与肿瘤位置存在相关性，与性别、淋巴结转移、年龄、浸润深度、组织分化程度、TNM分期无相关性。对VEGF-A、ADD1两者相关性分析显示，VEGF-A与ADD1在GC组织中的表达呈正相关。生存率分析结果显示，VEGF-A高表达组OS及DFS显著低于VEGF-A低表达组，提示VEGF-A与GC预后有相关性。分析其原因，恶性肿瘤细胞增殖、分化及转移需要大量营养元素，而人体内营养物质主要借助新生血管运输至各个部位，因此当肿瘤发生时人体内重要的血管生成调节因子VEGF-A被激活，促进肿瘤进行增殖及迁移。

ADD1 是细胞膜骨架蛋白Adducin家族的重要成员，具有维持细胞膜稳定性及胞间信号转导功能的作用。它不仅参与构建细胞膜骨架网状结构，还参与细胞增殖、细胞膜离子转运、细胞黏附等细胞的生命活动。ADD1 是一个由22个残基组成MARCKS结构域的异源二聚体，位于MARCKS结构域中的磷酸化位点可被PKA、PKC、Src 蛋白激酶磷酸化，被磷酸化后的ADD1与肌动蛋白、血影蛋白之间的交互作用能力降低，使得细胞间黏附力减弱，导致细胞异常生长和分化。Kim等[13]发现，ADD1磷酸化与宫颈癌易感性相关。王梦菡等[14]发现，ADD1基因的磷酸化位点错义突变rs4963可能是非贲门GC的遗传易感因素。本研究结果显示，GC组织中ADD1高表达率显著高于癌旁正常组织，提示ADD1参与GC的发生，这与郭雄图等[15]的研究结果相吻合。此外，本研究结果提示ADD1表达水平与组织分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移存在相关性，与性别、年龄、肿瘤位置无相关性。对VEGF-A、ADD1两者相关性分析显示，ADD1与VEGF-A在GC组织中的表达呈正相关，提示VEGF-A、ADD1在GC的发生发展过程中有着密切关系。生存率分析结果显示，ADD1高表达组OS及DFS显著低于ADD1低表达组，提示ADD1与GC预后有相关性。磷酸化是调控细胞生命活动的重要手段，可改变蛋白质活性，也可影响细胞增殖、分化及凋亡，由于ADD1可被多种蛋白激酶磷酸化，被磷酸化后的 ADD1失去正常调控功能，从而导致细胞恶性增殖。

综上所述，VEGF-A、ADD1在GC组织中呈高表达，VEGF-A表达水平与GC患者肿瘤位置及GC预后呈相关性，ADD1表达水平与GC患者组织分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移及GC预后呈相关性，且VEGF-A与ADD1在GC组织中的表达呈正相关。但本研究存在一定局限性，如指标观察的半定量性质、取材的局限性、纳入病例数较少、研究时间较短等，仍需今后进一步深入研究。