lncRNA-SChLAP1在肝细胞癌中的表达及临床意义

肝细胞癌(HCC)是常见的原发性肝脏恶性肿瘤，在非洲和亚洲的发病率较高。HCC位居中国恶性肿瘤发病率的第3位，在全球范围内的发病率接近55%。现有治疗方法的长期效果尚不能令人满意，HCC患者的复发和远处转移仍然呈升高趋势[1]。因此，对疾病进展的生物标志物的研究对优化治疗结果具有重要的意义。

长链非编码RNA(lncRNA)具有调节转录、翻译、细胞分化、基因表达调控、细胞周期调控、染色质修饰和细胞核-细胞质之间的运输等多种功能，在肿瘤形成、预后标志物作用、治疗模式风险预测等方面起着非常重要的作用[2]。SChLAP1是一种新型的前列腺癌标志物，与前列腺癌的发生发展密切相关[3]。Prensner首次报道SChLAP1是一个在前列腺癌的子集中过度表达并与致命疾病相关的lncRNA，涉及到肿瘤细胞的入侵和转移[4]。本课题组的前期研究已经证明SChLAP1与结直肠癌的预后明显相关[5]。本研究通过检测HCC及瘤旁组织中lncRNA-SChLAP1的表达情况，并分析其与临床病理学特征的相关性，从而阐明SChLAP1在HCC中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2008年4月至2014年6月丹东市第一医院、沈阳市第五人民医院行手术切除后经病理学证实为HCC的92例肿瘤组织标本(包括癌旁肝组织46例)。病理参数包括年龄、性别、肿瘤大小、门脉癌栓、TNM分期、肝硬化情况、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲胎蛋白(AFP)水平、无病生存时间及5年总生存率等。92例患者中，男性69例，女性23例；年龄为26～73岁，中位年龄为54岁；其中51例为早期(Ⅰ～Ⅱ)，41例为晚期(Ⅲ～Ⅳ)。92例患者手术前均未接受放射、化学治疗，HCC患者术后随访5年，或直至死亡。经医院伦理委员会批准，所有患者均签属了知情同意书。

1.2 RNA提取及实时定量PCR

使用试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，购自日本TaKaRa公司)根据制造商的指示提取组织样本的总RNA，通过逆转录酶引物合成第一链cDNA和低聚糖(dT)。取出2 μL产物进行PCR反应，反应条件：95 ℃ 10 min；95℃ 15s，60℃ 60s，40次循环，之后行3%琼脂糖凝胶电泳[6]。应用ChampChemi专业图像分析系统(中国赛智公司)和Lane 1D凝胶成像分析软件(中国赛智公司)对蛋白条带进行量化。实时定量PCR实验均为3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据，运用公式RQ=2-ΔΔCt进行分析。引物序列见表1。

表1 PCR反应引物序列

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。HCC及癌旁组织中SChLAP1表达水平之间的比较、SChLAP1表达与临床病理学参数之间的关系比较用卡方检验和确切Fisher′检验；Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank法进行生存分析；Cox风险回归模型进行总生存期单因素及多因素分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SChLAP1在HCC组织中的表达及其与临床参数的关系

实时定量PCR方法检测结果显示，SChLAP1在92例HCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 SChLAP1 在不同组织中的表达水平

以SChLAP1表达的中位数(4.452)作为分界点，将92例患者的SChLAP1表达水平分为高表达组55例和低表达组37例。HCC组织中SChLAP1的高表达率与肿瘤大小、有无门脉癌栓、临床分期明显相关，即SChLAP1在肿瘤较大、有门脉癌栓、Ⅲ～Ⅳ级的患者中表达水平较高。同时，SChLAP1的表达与患者的年龄、性别、是否有肝硬化、HBsAg和AFP的水平无相关性。见表2。

2.2 SChLAP1的表达与HCC患者的预后

应用Kaplan-Meier绘制生存曲线，结果显示SChLAP1高表达的患者的无病生存率和总生存率均明显低于低表达者(无病生存率Log-rank=11.077，P=0.001；总生存率Log-rank=10.728，P=0.001，见图2)。门脉未侵犯组、早期组和晚期组患者行组内比较显示，SChLAP1高表达者的无病生存率和总生存率均低于低表达者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3、图4。但SChLAP1的表达水平在门脉已侵犯组内的差异无统计学意义。

表2 SChLAP1的表达与HCC临床病理学特征的关系

图2 SChLAP1的表达水平对患者生存率的影响A无病生存率B总生存率

图3 SChLAP1的表达水平在门脉未侵犯时对患者生存率的影响A无病生存率B总生存率

图4SChLAP1的表达水平在不同临床分期中对患者生存率的影响A早期患者无病生存率B早期患者总生存率C晚期患者无病生存率D晚期患者总生存率

Cox风险回归模型统计结果显示，HCC中SChLAP1的高表达与临床分期均是患者总生存率的独立影响因子(P<0.01，见表2)。

表2 Cox回归模型分析HCC患者预后影响因素

3 讨论

lncRNA参与了多种生物学过程，包括多能干细胞重编程、致癌进展和细胞周期调控等，在导致疾病(包括肿瘤)进展的基因表达调控方面扮演着重要的角色。最近研究表明，lncRNA失调不仅会影响真核基因组的调节，而且还会给恶性细胞带来生长优势，导致肿瘤进行性和不受控制性生长。HCC的起源和预后与lncRNA关系密切。Liu等[7]收集了162例HCC组织和癌旁组织，通过实时定量PCR检测了lncRNA-HOST2的表达，结果显示HCC组织中lncRNA-HOST2的表达较邻近的正常组织升高了2～10倍。在人类HCC细胞系SMMC-7721中，lncRNA-HOST2能促进细胞增殖、迁移并抑制细胞凋亡；Xu等[8]证实了一种新的lncRNA-Myd88在体外和体内均可促进HCC细胞的增殖和转移，通过增强Myd88基因的启动子，lnc-Myd88可以升高下游基因Myd88表达，导致核因子κB(NF-κB)和PI3k/ARKT信号通路激活。Wang等[9]报道，lncRNA-DILC介导了肿瘤坏死因子α(TNF-α)/NF-κB信号和自体分泌白细胞介素-6(IL-6)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)级联反应之间的串扰，并将肝脏炎性反应与肝癌干细胞的扩增联系起来，表明lncRNA-DILC可能不仅是一个潜在的预后生物标志物，还是针对肝癌干细胞的治疗靶点。因此，lncRNA可能在HCC的演进过程中具有重要功能。

SChLAP1被命名为与前列腺-1相关的第2个染色体基因座，也称为LINC00913。Prensner等[4]在前列腺癌患者中发现，SChLAP1呈过表达，且可以作为患者预后不良的独立风险预测指标，包括肿瘤的转移和前列腺癌特异性死亡；同时，该研究通过体外及体内功能获得和功能缺失实验表明，SChLAP1对SWI/SNF染色质修饰的基因组定位和调控产生抵抗，阻断了SWI/SNF复合物的抑癌功能，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，导致致死性肿瘤的进展。本研究结果显示，HCC组织中SChLAP1 mRNA的表达水平明显高于癌旁组织，且与肿瘤大小、门脉癌栓的形成及临床分期等预后因素呈密切相关。生存分析结果表明，SChLAP1高表达的患者无病生存率及总生存率均明显低于低表达的患者，提示SChLAP1对HCC的预后具有可靠的评估意义。门脉侵犯和临床分期是HCC公认的预后影响因子。本研究发现，在门脉未侵犯的患者中，高表达者的无病生存率和总生存率均明显低于低表达者；无论是在早期还是晚期患者中，高表达者的无病生存率和总生存率均明显低于低表达者，提示可以将SChLAP1、门脉侵犯与否及临床分期联合评估HCC的预后情况。经Cox风险回归模型统计发现，SChLAP1的高表达和临床分期均是影响HCC患者生存率的独立风险因素。因此，SChLAP1可以作为一个潜在的生物标志物，起到对HCC预警以及治疗靶标的作用。

目前，对于HCC相关lncRNA及SChLAP1的研究仍然较少，它们在HCC细胞恶性演进过程中的作用机制需要研究者深入分析，尤其是对SChLAP1的进一步探索将为HCC预后评估和靶向治疗提供新的生物标志物。