溃疡性结肠炎患者结肠黏膜5-HT信号通路的变化特点

溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠病(IBD)，其特征是结肠黏膜和黏膜下慢性炎性反应，临床表现主要包括腹泻、便血和腹痛。UC的发病机制尚未完全明确[1]。

肠道5-羟色胺(5-HT)主要由肠嗜铬(EC)细胞合成、贮存和释放[2]。EC细胞通过色氨酸羟化酶1(TPH1)合成5-HT，5-HT释放后，一部分作用于各种5-HT受体发挥生物学效应，另一部分被5-HT再摄取转运蛋白(SERT)摄取到上皮细胞中，经单胺氧化酶代谢而终止作用。5-HT在胃肠道的运动、分泌和感觉调节中起着关键作用[3]。研究发现5-HT与肠道疾病如肠易激综合征、IBD有关[2,4-5]。有研究报道UC患者结肠黏膜中5-HT信号通路的变化，但结果不一致[2]。本课题组研究了5-HT信号通路在UC患者结肠黏膜中的变化，并分析了5-HT释放量与UC疾病活动度的相关性，以期进一步了解UC的发病机制。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

本研究选择2016年6月至2018年1月在香港大学深圳医院接受诊治的18例活动期UC患者，另选择11名同期的健康体检者作为健康对照组。UC患者包括11例男性和7例女性，年龄范围24～68岁，平均年龄(45.3±12.0)岁，平均病程(4.5±3.1)年。UC的诊断根据溃疡性结肠炎共识第1部分，采用Mayo病活动指数(DAI)评估UC疾病活动度(3～5分为轻度，6～10分为中度，11～12分为重度)[6]。UC组与健康对照组的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。两组均未使用针对5-HT系统的药物(如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、5-HT4激动剂或5-HT3拮抗剂)。通过结肠镜下活组织检查获得两组的结肠黏膜组织标本。本研究获得医院伦理委员会批准，所有入选者均知情同意。

表1 两组一般情况

1.2 结肠黏膜5-HT含量的测定

按照说明书制备结肠黏膜组织匀浆，使用酶免疫分析试剂盒(美国ENZO公司)检测5-HT含量。组织中5-HT含量单位为ng/mg。

1.3 结肠黏膜5-HT释放量的测定

每个受试者均取两块结肠黏膜活组织标本用来检测5-HT释放量。将标本置于37 ℃、5% CO2的组织培养板中(24孔)，在1 000 μL含有10%胎牛血清(美国Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中孵育24 h，吸取培养液后离心，获取上清液，用酶免疫测定试剂盒(美国ENZO公司)测定释放到上清液中的5-HT量。

1.4 免疫荧光法检测5-HT、TPH1和SERT的分布和表达

将结肠黏膜活组织标本固定在10%的中性甲醛中过夜，常规制备石蜡切片。石蜡切片经脱蜡和水化后，经pH 6.8的枸橼酸钠溶液用高压锅行抗原热修复，在室温下0.1 mol/L PBS溶液(含5%正常驴血清和0.3%Triton X-100)中孵育30 min，4 ℃孵育一抗过夜，使用的一抗包括山羊抗人5-HT(1∶1 000)、兔抗人SERT(1∶100)和兔抗人TPH1(1∶100)，均购自美国Abcam公司。切片用PBS溶液洗3次，在室温下用相应的二抗孵育1 h，使用的二抗包括Alexa Fluor 594标记的驴抗山羊IgG(1∶200)和Alexa Fluor 594标记的驴抗兔IgG(1∶200)，均购自美国Jackson ImmunoResearch公司。切片用PBS溶液洗3次，再用包含DAPI的抗荧光衰减试剂封片(美国Cell Signaling公司)，用荧光显微镜进行图像采集和分析。

1.5 图像分析EC细胞数量

用荧光显微镜观察5-HT和DAPI染色的免疫反应性，使用20倍高倍镜获取图像。5-HT免疫反应呈红色，DAPI复染细胞核为蓝色，位于结肠黏膜内的5-HT免疫阳性细胞即EC细胞。每个切片随机选取3个视野计数EC细胞数量和隐窝数量[24]，计算隐窝的EC细胞平均数(3个视野的EC细胞总数÷3个视野的隐窝总数)。

1.6 结肠黏膜TPH1和SERT的mRNA表达水平

采用qRT-PCR检测TPH1和SERT的mRNA表达水平。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(德国Qiagen公司)，从新鲜冷冻结肠黏膜组织中提取和纯化总RNA。测定所有样品的RNA量，凝胶电泳评估RNA完整性。使用QuantiNova Reverse Transcription试剂盒(德国Qiagen公司)进行反转录，将所得的cDNA用于qRT-PCR。

qRT-PCR在LightCycler 480实时热循环仪(德国Roche公司)中进行，反应体积为20 μL。TPH1、SERT和内参基因β-肌动蛋白的mRNA水平采用QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒(德国Qiagen公司)进行PCR检测。PCR扩增条件为95 ℃、5 s，然后95 ℃、5 s和60 ℃、10 s进行40个循环。用2-ΔΔCt法将SERT和TPH1的mRNA水平与内参基因β-肌动蛋白进行标准化，并与健康对照组进行比较。所有引物购自上海英潍捷基公司，SERT的正义引物为5′-TTGGACGTGTGAGGAT GTGG-3′，反义引物为5′-TCCCTGTTCTCTC CTACGCA-3′；TPH1的正义引物为5′-ACGTCGA AAGTATTTTGCGGA-3′，反义引物为5′-AC GGTTCCCCAGGTCTTAATC-3′；β-肌动蛋白的正义引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反义引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGA T-3′。

1.7 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示。比较UC组和健康对照组时，用Studentt检验分析比较组间均数，用卡方检验分析计数资料。采用线性回归分析确定5-HT释放量与UC疾病活动度的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-HT的含量

如图1A所示，UC组结肠黏膜中5-HT含量[(67.48±21.14)ng/mg]显著高于健康对照组[(24.69±7.08) ng/mg]，差异有统计学意义(P<0.001)，说明UC患者结肠黏膜5-HT的含量增加。

2.2 TPH1的表达

肠道5-HT绝大部分由EC细胞合成、储存和分泌。5-HT生物合成的限速酶为TPH1。UC患者结肠黏膜中5-HT含量增加是否与5-HT合成增加有关？本研究采用RT-PCR定量研究TPH1的mRNA表达水平。结果显示，与健康对照组(1.01±0.18)相比，UC组结肠黏膜中TPH1的mRNA水平(2.01±0.43)显著升高，差异有统计学意义(P<0.001)，见图1B。免疫荧光法检测发现，结肠黏膜隐窝内TPH1免疫反应性呈红色，DAPI复染细胞核为蓝色，UC组结肠黏膜中TPH1的免疫反应性较对照组升高，提示其TPH1蛋白表达水平显著升高，见图1C和1D。UC患者结肠黏膜中TPH1表达水平升高，提示5-HT合成增加。

图1结肠黏膜中5-HT含量和TPH1表达A两组的5-HT含量比较B两组的TPH1 mRNA表达水平比较C对照组TPH1的免疫荧光反应(红色) ×200DUC组TPH1的免疫荧光反应(红色) ×200

2.3 EC细胞的数量

为了确定结肠黏膜中5-HT含量增加是否与EC细胞数量增加有关，本研究通过免疫荧光标记结肠黏膜中5-HT来定量检测EC细胞。如图2A和2B所示，结肠黏膜隐窝内5-HT免疫反应性呈红色，DAPI复染细胞核为蓝色，UC组的5-HT免疫反应性较对照组升高。如图2C所示，定量分析显示UC组结肠黏膜中每个隐窝的EC细胞数量[(1.3±0.3)个]比对照组[(0.5±0.1)个]显著增加(P<0.001)。

图2结肠黏膜中EC细胞数量A对照组的5-HT免疫荧光反应(红色) ×200BUC组的5-HT免疫荧光反应(红色) ×200C两组的EC细胞数量定量分析比较

2.4 5-HT的释放量及其与UC疾病活动度的相关性

结肠黏膜5-HT释放量如图3A所示，与健康对照组[(15.18±3.42)ng/mg]相比，UC患者5-HT释放量显著增加[(81.16±16.62)ng/mg]，差异有统计学意义(P<0.001)。这表明随着TPH1表达水平的升高，5-HT含量和EC细胞数量的增加，结肠黏膜5-HT释放量也增加。相关分析显示，UC组结肠黏膜5-HT释放量与UC疾病活动度(Mayo评分)呈线性正相关(r=0.735，P=0.001)，见图3B。

图3结肠黏膜5-HT释放量及其与UC疾病活动度的相关性A两组结肠黏膜5-HT释放量比较B结肠黏膜5-HT释放量与UC疾病活动度的相关性分析

2.5 SERT的表达

上述数据表明UC组结肠黏膜5-HT的释放量增加，然而，如果5-HT释放后被再摄取灭活的能力受到影响，5-HT信号通路可能改变。为了确定SERT在UC组结肠黏膜中的表达是否发生改变，本研究采用免疫荧光法检测发现，SERT广泛表达于结肠黏膜细胞，阳性表达的细胞染色为红色。与对照组相比，UC患者结肠黏膜中SERT的免疫反应性显著降低(见图4A和4B)，提示结肠黏膜中SERT的蛋白表达水平也降低。本研究采用qRT-PCR法检测SERT的mRNA表达水平，发现与对照组(1.05±0.33)相比，UC组结肠黏膜中SERT mRNA表达水平(0.33±0.14)显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)，见图4C。

图4结肠黏膜中SERT表达水平A对照组的SERT免疫荧光反应(红色) ×200BUC组的SERT免疫荧光反应(红色) ×200C两组的SERT mRNA表达水平比较

3 讨论

UC发病率在全球普遍升高，其发病机制尚未完全清楚。5-HT在肠道运动、分泌和感觉功能中起着重要作用，并可加重结肠炎动物模型的炎性反应[5]，因此UC发病可能与5-HT信号通路的改变有关。有关UC患者结肠黏膜5-HT信号通路异常的研究报道较少，而且结果不一致[2]。

本课题对UC患者结肠黏膜5-HT信号通路的变化以及5-HT释放量与UC疾病活动度的相关性进行了研究。肠黏膜中5-HT信号通路涉及5-HT的合成、储存、释放和再摄取降解。本研究结果表明，5-HT信号通路的几个关键环节在UC患者中发生改变，包括结肠黏膜中EC细胞增加、5-HT含量增加、合成酶TPH1表达上调以及SERT下调而导致的5-HT再摄取改变，这些改变导致UC患者结肠黏膜中5-HT的有效性增强。此外，本研究还发现结肠黏膜5-HT释放量与UC疾病活动度呈正相关。

本研究发现，UC组结肠黏膜中EC细胞数、5-HT含量和TPH1表达水平高于健康对照组，表明UC组结肠黏膜中5-HT的有效性增强。EC细胞中5-HT合成的限速酶TPH1表达升高，提示EC细胞合成5-HT增加。以往研究表明，UC患者结肠黏膜中EC细胞数量和5-HT含量增加[7-8]，与本研究结果一致。然而，也有研究发现重度UC患者的结肠黏膜中EC细胞数量减少[9]，这可能是由于重度UC患者结肠黏膜损伤导致EC细胞数量减少，也可能与EC细胞计数方法有关(EC细胞数量÷上皮细胞数量)，UC患者结肠黏膜细胞增生可能导致EC细胞计数结果减少。

本研究发现UC患者结肠黏膜5-HT释放量增加，提示结肠黏膜中5-HT含量和EC细胞数量的增加改变了5-HT的释放量。动物实验发现结肠炎性反应时5-HT释放量增加[10]，但也有研究发现UC患者结肠黏膜5-HT释放量无改变[9]，这可能与检测方法有关，结肠黏膜5 min的5-HT释放量可能不足以反映炎性反应的黏膜与正常黏膜的差异。本研究检测结肠黏膜24 h的5-HT释放量，发现炎性反应黏膜较正常黏膜释放更多的5-HT。释放量增加的5-HT可能作用于各种5-HT受体，从而诱导更强的生物学作用。动物实验发现，5-HT可诱导动物结肠炎性反应加重[11]，TPH1基因敲除小鼠[5]和TPH1抑制剂[12-13]均可使小鼠的结肠炎性反应显著减轻。本研究发现，5-HT释放量与UC疾病活动度(Mayo评分)呈正相关性。因此，UC患者结肠黏膜5-HT释放量增强，可能导致结肠炎性反应加重。

本研究还发现，UC组结肠黏膜5-HT摄取转运蛋白SERT的mRNA和免疫反应水平下调。以往研究发现UC患者结肠黏膜中SERT表达在蛋白和转录水平上均显著降低[9,14]，动物结肠炎模型研究也有类似的结果[15]，本研究结果与以往研究结果一致。临床研究发现，选择性5-HT再摄取抑制剂的应用与显微镜下结肠炎有关[16]。缺乏SERT的转基因小鼠可出现更严重的结肠炎[17]。因此，UC患者结肠黏膜SERT表达降低，提示5-HT再摄取灭活可能受损，可能也导致了5-HT有效性增强，导致结肠炎性反应加重。

总之，本研究结果表明，UC患者结肠黏膜5-HT信号通路多个环节发生异常改变，包括EC细胞数量增加、5-HT合成酶TPH1表达升高、5-HT含量和释放量增加，以及5-HT再摄取转运蛋白SERT表达下调，导致结肠黏膜5-HT的有效性增强。此外，结肠黏膜5-HT释放量与UC疾病活动度呈正相关。鉴于5-HT在肠道运动、感觉、分泌功能和炎性反应中的作用，UC患者的临床症状可能与结肠黏膜的5-HT信号通路异常改变有关。今后有必要进一步研究5-HT在UC患者结肠炎性反应中的作用，以及以5-HT信号通路为靶点的药物对UC患者的治疗作用[2,18]。