血清半乳糖血凝素-1、紧密连接蛋白-1对甲状腺癌病情评估的价值

徐 斌，应 红

(重庆市急救医疗中心核医学科,重庆 400014)

甲状腺癌是全世界常见的内分泌肿瘤之一，包括甲状腺乳头癌和甲状腺滤泡癌，前者是最常见的甲状腺癌，极少发生淋巴转移，预后较好；后者更具侵袭性，恶性程度较高[1]。甲状腺腺瘤是起源于甲状腺滤泡的良性肿瘤，切除后即可治愈,预后良好。目前，刺针穿刺活检是常见的鉴别诊断甲状腺肿瘤的方法，但用组织病理学鉴别甲状腺癌与良性肿瘤，甲状腺乳头癌和甲状腺滤泡癌的亚型仍存在一定误差[2]，需结合甲状腺癌筛查的血清指标，以增加灵敏度及特异度。半乳糖血凝素-1(Gal-1)是一种缺氧诱导因子，作为真核细胞里缺氧应答的关键性转录调节因子，在肿瘤形成过程中起主要作用[3]。紧密连接蛋白-1(Cla-1)属于跨膜蛋白家族，在细胞黏附和上皮细胞极性中具有关键作用[4]。以往研究表明，Gal-1和Cla-1在正常组织和肿瘤组织中表达差异较大，但在血清中表达差异的研究较少。本文将探讨甲状腺癌患者血清中Gal-1和Cla-1表达情况，为甲状腺癌早期诊断和筛查提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究经本院医学伦理委员会批准(2015011)，且患者均签署知情同意书。选取2015年1月至2017年9月本院收治的104例甲状腺疾病患者，经患者知情同意后，临床治疗前清晨空腹采集静脉血2 mL，低速离心机 4 ℃ 4 000 r/min离心15 min，分离获得血清，手术切除甲状腺疾病组织标本于-80 ℃冰箱保存。按2004年WHO病理组织学分类标准，其中甲状腺乳头癌32例，男6例，女26例，平均年龄(47.76±6.54)岁；甲状腺滤泡癌18例，男3例，女15例，平均年龄(49.21±8.34)岁；甲状腺腺瘤54例，男10例，女44例，平均年龄(50.42±7.24)岁。同时，随机选取20例甲状腺功能各指标、甲状腺彩超均正常的志愿者为对照组，男10例，女10例，平均年龄(46.64±6.54)岁，收集其血清标本。以上病例均经病理学确诊。

1.2主要试剂 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国Sigmag公司，兔抗人Gal-1、Cla-1单克隆抗体购自英国Abcam公司，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，山羊抗兔二抗购自武汉博士德。PAGE凝胶配制试剂盒、蛋白提取试剂盒购自上海碧云天。Trizol试剂、逆转录试剂盒和qRT-PCR检测试剂盒均购自Takara。PCR引物自行设计并交由上海生工合成。

1.3方法

1.3.1ELISA检测血清Gal-1、Cla-1的水平 将冻存血清复温，每批检测设空白、阴性对照各2孔，严格按照说明书进行操作。在TECAN Safire全自动酶标分析仪上450 nm处读取吸光度(A)值，每孔测定3次，取均值。参照试剂盒操作步骤与方法绘制标准曲线，并求水平与吸光度的回归方程，依据标准曲线和回归方程确定各样品Gal-1、Cla-1的水平。

1.3.2Western bolt检测组织中Gal-1和Cla-1蛋白水平 将对照组甲状腺组织和各组甲状腺癌组织用RIPA裂解细胞后提取组织蛋白，采用BCA法测定蛋白水平，加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液(5×)沸水浴15 min使蛋白变性。将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜至硝酸纤维膜。用5% BSA封闭2 h后加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。吸弃一抗，TBST洗膜，15 min/次，共3次，然后用TBST稀释二抗(1∶2 000)，室温杂交1 h。同前洗膜3次后室温下ECL显色，以GAPDH(1∶200)作为内参。Image J软件分析确定杂交条带的相对灰度值。

1.3.3qRT-PCR检测组织Gal-1、Cla-1和肿瘤组织恶性行为基因表达 分别取约50 mg甲状腺癌组织置于2 mL EP管中，加入1 mL Trizol 用组织匀浆机剧烈匀浆5 min，将匀浆液转移到EP管中加入200 μg氯仿混匀后，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min取上清，加入等体积的异丙醇混匀，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，用800 μL 75%的乙醇洗涤，待乙醇挥发后加入50 μL的DEPC水溶解备用。取RNA溶解定量后，取2 μg RNA 37 ℃反转录1 h。使用qRT-PCR检测试剂盒检测基因的表达。扩增管家基因GAPDH作内对照。反应条件为：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 30 s、56 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，40个循环。以IQ5.0软件对PCR数据进行统计学分析，以各组目的基因表达水平与内参的比值为该基因的校正表达水平。扩增目的基因mRNA如下：细胞增殖促进基因EDAG-1、Survivin、CCNG2；肿瘤侵袭基因:STAT3、FAK、Beclin-1。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结 果

2.1血清Gal-1、Cla-1水平的比较 4组研究对象性别差异有统计学意义(P<0.05)，年龄差异无统计学意义(P>0.05)。4组血清Gal-1(Z=76.65，P<0.000)、Cla-1(Z=58.64，P<0.000)水平差异均有统计学意义，其中甲状腺乳头癌组血清Gal-1和Cla-1水平均高于甲状腺滤泡癌组、甲状腺腺瘤组、对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；甲状腺滤泡癌血清Gal-1和Cla-1水平均高于甲状腺腺瘤组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，甲状腺腺瘤组Gal-1水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清Gal-1、Cla-1水平比较

注：与对照组相比，aP<0.05；与甲状腺腺瘤相比，bP<0.05；与甲状腺滤泡癌相比，cP<0.05

2.2甲状腺癌组织中Gal-1、Cla-1 mRNA和蛋白的表达 qRT-PCR和Western bolt结果显示，与对照组相比，甲状腺乳头癌组、甲状腺滤泡癌组、甲状腺腺瘤组的组织中Gal-1、Cla-1 mRNA水平和蛋白显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A表示 Gal-1 和 Cla-1 mRNA表达水平；B表示Gal-1 和 Cla-1 蛋白表达水平；C表示Gal-1和Cla-1蛋白分析结果；与对照组比较，*P<0.05

图1Gal-1、Cla-1在组织中的表达

注：A为CCNG2；B为EDAG-1；C为Survivin；D为STAT3；E为FAK；F为Beclin-1；与对照组相比，*P<0.05

图2肿瘤组织中肿瘤细胞增殖促进基因和肿瘤侵袭基因mRNA表达情况

2.3肿瘤组织中肿瘤细胞增殖促进基因和肿瘤侵袭基因mRNA表达 qRT-PCR结果显示，与对照组相比，甲状腺癌患者肿瘤细胞增殖促进基因EDAG-1、Survivin mRNA表达量均显著升高(P<0.05)，CCNG2 mRNA表达量显著降低(P<0.05)。甲状腺癌患者肿瘤组织中肿瘤侵袭基因STAT3、FAK mRNA相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，甲状腺乳头癌组、甲状腺滤泡癌组、甲状腺腺瘤组Beclin-1 mRNA表达显著降低(P<0.05)。见图2。

2.4血清Gal-1、Cla-1和肿瘤增殖与肿瘤侵袭基因之间的相关性分析 Pearson相关性分析显示，甲状腺癌患者的血清Gal-1与EDAG-1、Survivin、FAK呈明显正相关关系，与CCNG2、Beclin-1呈明显负相关关系，而与STAT3无明显相关性(r=0.13,P=0.928);血清Cla-1与Survivin、STAT3、FAK呈明显正相关关系，与CCNG2、Beclin-1呈明显负相关关系,而与EDAG-1无明显相关性(r=0.164,P=0.301)。见表3。

表3 血清Gal-1、Cla-1和肿瘤增殖与肿瘤侵袭基因之间的相关性分析

注：a表示呈显著正相关关系；b表示呈显著负相关关系

3 讨 论

无痛性甲状腺结节是甲状腺癌常见的临床表现之一，研究表明，高达50%的普通人群可能患有甲状腺结节。临床上常使用细针穿刺、触诊、超声、CT、MRI等检测方法对甲状腺结节进行诊断分类，但这些方法都存在不同缺陷[5]。因此，寻找一种甲状腺疾病血清生物标志物，对甲状腺癌的早期筛查、评估甲状腺癌的转移及进展具有重要意义。

本研究发现，甲状腺癌中肿瘤恶性程度越高，血清中的Gal-1、Cla-1水平越高。WU等[6]研究发现，甲状腺癌患者血清Gal-1在Ⅲ期和Ⅳ期中显著升高，且与患者淋巴结转移有关。ARCOLIA等[7]研究指出，Gal-1在69例甲状腺病变的上皮内完全消失，而在恶性甲状腺细胞的细胞质中显着增加。SALAJEGHEH等[8]研究报道，Gal-1蛋白在32%的原发性甲状腺乳头状癌中过表达，53%转移性乳头状甲状腺癌的淋巴结中表达显著增加，47%的原发性转移的淋巴结也显著增加，在淋巴结转移的乳头状甲状腺癌中Gal-1蛋白过度表达。PALACIOS-CORONA等[9]研究表明，石蜡包埋的甲状腺腺瘤、滤泡和乳头状癌的Gal-1相对附着水平均高于对照组，并在腺瘤黏附细胞的平均值与滤泡和乳头状癌样本之间发现显著差异。本研究发现，甲状腺乳头癌中Gal-1表达显著高于对照组，甲状腺癌中Gal-1高于良性肿瘤，与以上研究结果一致；各组中女性患者人数多于男性且差异有统计学意义，可能与甲状腺癌女性多发有关。

SUREN等[10]研究报道，在甲状腺恶性肿瘤和良性肿瘤中Cla-1差异具有显著性，与对照组相比，乳头状癌和滤泡状癌中Cla-1表达差异有统计学意义，该报道和本文结果一致。ZWANZIGER等[11]对淋巴结转移组织分离的FTC-133细胞和从肺转移的FTC-238细胞进行体外实验发现，与FTC-133细胞相比，FTC-238细胞核中Cla-1蛋白表达显著性升高，并且FTC-133细胞中Cla-1的过表达可能受磷酸化影响而导致细胞迁移和侵袭的增加。提示细胞核中Cla-1磷酸化活性改变可能是影响甲状腺癌发生、发展的机制之一。

高表达的Gal-1、Cla-1可以证实其与甲状腺癌发生、发展有关，但并不能说明其与肿瘤恶性行为的内在联系。肿瘤细胞的增殖和侵袭是特异性改变，也是恶性改变发生、发展的基础，本文分析了甲状腺癌和甲状腺腺瘤患者血清Gal-1和Cla-1水平与癌症细胞增殖促进基因和肿瘤侵袭基因的mRNA表达量的相关关系，发现两者存在一定的相关关系。CCNG2、EDAG-1、Survivin均是已有文献报道的甲状腺癌增殖相关基因。王倩倩等[12]研究发现，CCNG2基因可通过上调P53基因表达水平，抑制甲状腺乳头癌K1细胞增殖、促进细胞凋亡作用。CHEN等[13]研究发现，EDAG-1的过度表达促进了人类甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和黏附。Survivin是凋亡抑制蛋白，大量研究表明其在恶性肿瘤组织中表达很高，而在健康成人组织中表达极低[14]。

STAT3、FAK、Beclin-1作为肿瘤侵袭基因可直接影响肿瘤细胞的转移能力，其异常表达是肿瘤恶性病变的重要原因。STAT3是信号转导子与转录激活子家族的重要成员，研究表明其可通过促进MMP2的表达，改变细胞与细胞外基质间的黏附能力，促进肿瘤内皮细胞的迁移和新生血管的形成，为肿瘤转移打开通道[15]。FAK是胞内的重要信号分子，介导细胞内信号网络系统的交联，在肝癌、胃癌、甲状腺癌研究中发现，侵袭性肿瘤和伴有转移的肿瘤FAK基因表达增加[16]。Beclin-1是哺乳动物参加自噬的双等位抑癌基因，可通过参与调节恶性肿瘤的自噬活性在肿瘤的发生、发展中起重要作用[17]。本研究发现，血清Cla-1和Cla-1与甲状腺癌组织CCNG2、EDAG-1、Survivin、STAT3、FAK、Beclin-1有一定的相关关系，提示Gal-1和Cla-1可能与甲状腺肿瘤的恶性病变有关。

4 结 论

甲状腺癌患者血清Gal-1和Cla-1水平显著升高，并与甲状腺癌恶性程度直接相关，血清Gal-1和Cla-1可以作为甲状腺癌的辅助诊断因子，以提高甲状腺癌的早期检出率,具体的分子作用机制值得进一步研究。