剑麻AsLEC基因克隆及生物信息学分析

鹿志伟 侯晓婉 杨子平 张燕梅 李俊峰 周文钊

摘  要  单子叶甘露糖结合植物凝集素基因能够有效抑制具有刺吸式口器的同翅目害虫的生长与繁殖，它被证实在掌叶半夏、小麦、烟草、棉花等单子叶和双子叶植物中均具有较好的抗虫效果，但其在剑麻中的功能尚缺乏深入研究。本研究以剑麻为材料，利用RT-PCR技术成功克隆剑麻lectin基因，命名为AsLEC，并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因CDS序列全长为561 bp，編码186个氨基酸，蛋白质分子量预测为19.97 ku，理论等电点为4.96，为疏水性蛋白;同源氨基酸序列比对结果表明剑麻lectin基因与火烧兰、雪花莲、君子兰与菠萝等植物的单子叶甘露糖结合凝集素基因同源性较高，氨基酸匹配度达到48%以上，系统进化树分析表明AsLEC基因与火烧兰亲缘关系更近;对AsLEC基因进行功能结构域分析表明其具有B-lectin基因家族典型特征，属于B-lectin基因家族成员;功能预测发现其具有一段33个氨基酸残基的信号肽，同时在N端第5～27位置处存在一个跨膜α螺旋，表明AsLEC蛋白为分泌型蛋白质，这与B-lectin蛋白的功能特点相吻合;AsLEC蛋白二级结构包含11个β折叠，3个α螺旋;亚细胞定位预测该基因很有可能定位在细胞膜上。剑麻AsLEC基因的克隆对于研究其在剑麻中的抗虫功能具有重要意义，同时丰富了单子叶植物中植物凝集素的相关研究成果。

关键词  剑麻;单子叶甘露糖结合植物凝集素;lectin

中图分类号  S563.8      文献标识码  A

Abstract  The monocotyl mannose-binding plant lectin gene can effectively inhibit the growth and reproduction of Homoptera pests with sucking mouthparts， and it was verified that those genes represent better resistance against insects in monocotyledonous and dicotyledonous plants such as Pinellia ternata， Triticum aestivum L.， Nicotiana tabacum L.， Gossypium spp. However， its function in sisal is still lack of in-depth study. In this study， sisal was used as materials， and the sisal lectin gene was successfully cloned by RT-PCR and named as AsLEC. Bioinformatics analysis were conducted. The results showed that the full-length CDS of AsLEC gene was 561 bp， encoding 186 amino acids. The protein molecular weight was predicted to be 19.97 ku， and the theoretical isoelectric point was 5.01， which was a hydrophobic protein. The results of homologous amino acid sequence alignment indicated that sisal lectin gene had high homology with the superfamily of monocotyl mannose-binding lectin gene in Epipactis helleborine， Leucojum vernum， Cliviaminiata， Ananas comosus （Linn.） Merr. and so on. The amino acid matching degree was more than 48%. The phylogenetic tree analysis indicated that AsLEC gene was more closely related to the lectin genes in Epipactis helleborine. Functional domain analysis of AsLEC gene suggested that it had the typical characteristics of the B-lectin gene family and belongs to the B-lectin gene family. A signal peptide of 33 amino acid residues was predicted in AsLEC protein， and there was a transmembrane alpha helix at the position from the 5th amino acid to the 27th amino acid in the N-terminus， which implyed that AsLEC protein was a secreted protein and was consistent with the functional characteristics of B-lectin protein. AsLEC protein secondary structure contained 11β-sheets， 3α-helices. Subcellular localization prediction showed that AsLEC gene was likely positioned on the cell membrane. Thecloning of sisal AsLEC gene was of great significance for studying its anti-insect function in sisal， and enriches the related research of plant lectin in monocotyledon.

Keywords  Agave sisalana; monocotyl mannose-binding plant lectin; lectin

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.013

新菠萝灰粉蚧（Dysmicoccus neobrevipes，Beardsley）属于同翅目（Homoptera）、粉蚧科（Pseudococcidae）、洁粉蚧属（Dysmicoccus），其主要分布在热带、亚热带地区，如夏威夷、斐济、牙买加、马来群岛、墨西哥、密克罗尼西亚、菲律宾以及中国台湾等国家和地区。1998年，新菠萝灰粉蚧首次出现在我国海南昌江剑麻种植区，并迅速大面积爆发，随后快速蔓延至广东湛江地区，被中国列为外来有害生物。针对该害虫，目前尚无有效的防治措施，其对我国剑麻产业发展带来了极大的损失[1]。而植物凝集素作为抗虫育种工作的重要资源，对于新菠萝灰粉蚧的防治具有重要作用[2-3]。

植物凝集素（lectin）是在植物中普遍存在的一类可以与单糖或者寡糖可逆性结合的蛋白质[4]，根据结合糖的特异性，植物凝集素主要包括单子叶甘露糖结合凝集素家族、木菠萝（Jacalin）凝集素家族、豆科类凝集素家族、几丁质结合凝集素家族、苋菜凝集素家族、Ⅱ-型核糖体失活蛋白家族、葫芦科韧皮部凝集素家族等7个蛋白质家族，其中单子叶甘露糖结合凝集素家族基因对同翅目刺吸式害虫具有较好的毒杀作用[2-3， 5]。如徐琼芳等[6]将雪花莲凝集素基因转入小麦中，发现其对蚜虫具有较好的抗性;Liu等[7]成功将AalT/GNA融合蛋白转入烟草后，其对咀嚼式和刺吸式昆虫表现出明显的抗性;肖松华等[8]报道转外源凝集素的棉花对棉蚜的吸引力降低。然而，植物凝集素在剑麻中是否具有相同或相似的功能有待进一步研究。

本研究拟在前期已完成转录组测序的基础上，根据转录组拼接序列设计剑麻lectin基因CDS全长序列克隆引物，并对克隆得到的基因序列进行氨基酸理化性质、同源氨基酸比对、进化树构建、功能结构域分析、亚细胞定位以及信号肽预测等一系列生物信息学分析，以期初步阐明剑麻lectin基因的一系列相关基础功能，为进一步深入研究其表型功能奠定理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

所用材料为中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻研究室种质资源圃保存的3年生剑麻H.11648叶片。

1.2  方法

1.2.1  總RNA的提取与cDNA链的合成  利用全式金生物技术有限公司的RN04-总RNA提取试剂盒（TRIzol法）对剑麻叶片进行总RNA提取，同时利用琼脂糖电泳及微量紫外分光光度计检测技术对总RNA质量进行检测分析。取3 μg总RNA，使用全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录合成cDNA。

对PCR产物纯化后，连接至pEASY?-T1 Cloning Kit（全式金公司）载体，然后转化大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞并进行蓝白斑筛选，挑选白色的阳性克隆菌斑后进行菌落PCR反应检测，最后送菌液至华大基因进行测序分析。

2  结果与分析

2.1  AsLEC基因T克隆菌落PCR结果

如图1所示，1、2、3三个菌落PCR结果中，1大小为561 bp左右，与目的条带大小一致，而2、3条带大小与目的条带不符，因此，菌落1可能为克隆的AsLEC基因菌落。

2.2  AsLEC基因编码蛋白质理化性质

以剑麻cDNA为模板，用AsLEC基因CDS全长引物LEC-F1，LEC-R1进行PCR扩增。扩增片段包含完整的CDS序列，长561 bp，编码186个氨基酸残基

利用ExPasy软件对剑麻AsLEC氨基酸序列的理化性质进行在线预测。结果表明AsLEC氨基酸序列的理论等电点（PI）为4.96，分子量为19.97 ku，AsLEC基因编码蛋白质的分子式为C893H1375 N231O273S8，蛋白质半衰期为30 h，不稳定指数为18.68，为稳定蛋白。AsLEC基因编码的蛋白有12个带负电荷的氨基酸残基（Glu+Asp），9个带正电荷的氨基酸残基（Lys+Arg），总的亲水性平均系数（Grand average of hydropathicity）为0.003，氨基酸组成见表1。

2.3  剑麻AsLEC功能结构域分析及同源氨基酸序列比对

利用NCBI在线软件对AsLEC蛋白功能结构域进行预测，结果表明该氨基酸属于B-lectin蛋白超家族[11]，见图3。通过NCBI的Blast工具对AsLEC基因序列进行在线分析，结果表明AsLEC与单子叶植物lectin基因同源性更高，氨基酸相图中数字表示氨基酸位置。

似性达到50%以上，其中与魔芋lectin （AHE93335.1）相似性达到60%，与姜黄lectin（AKT75734.1）相似性达到59%，与菠萝mannose-specific lectin-like（XP_020104167.1）相似性达到58%，与水仙lectin（ACR15122.1）相似性达到48%，与君子兰lectin（AAA19912.1）相似性达到53%，与雪花莲lectin（1MSA_A）相似性达到55%。

选取上述Blast的部分结果进行同源性比对（图4），由图2和图4可知，剑麻AsLEC氨基酸序列和其他植物lectin一样，具有B-lectin（Bulb-type mannose-specific lectin）基因家族的

AsLEC蛋白氨基酸序列与其他物种具有较高的同源性。其中，JNetPRED（prediction）即为蛋白质二级结构预测结果，

α螺旋（helices）用红色的条形表示，β折叠（sheets）用绿色箭头表示，差异主要出现在N端和C端，二级结构预测显示，

AsLEC蛋白含有11个β折叠。典型特征：氨基酸序列高度保守，每个多肽具有11个折叠，其中前3个为成熟蛋白质单体的Ⅰ型亚结构域，后面8个分别形成均具有4个折叠的Ⅱ和Ⅲ型亚结构域，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个亚结构域之间通过环相连（图5）。每个亚结构域表面的缝隙中均存在一个相同的保守性甘露糖结合位点（Q-D-N-V-Y，在图4中分别用红框做标记）。4个这样的单体通过非共价键结合成为成熟的蛋白质，上述Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个典型的亚结构域为B- lectin基因家族的标志性结构域[12-13]，表明克隆得到的基因片段为单子叶甘露糖结合凝集素类lectin基因，并命名为AsLEC。

2.4  AsLEC蛋白的信号肽及跨膜结构域预测

利用SignalIP4.1Server和TMHMM Server v.2.0在线软件对AsLEC蛋白进行信号肽和跨膜结构域预测，结果见图6和图7。从图6中可以看出，在AsLEC蛋白的N端第33～34位置处氨基酸的S值最为陡峭，C值最大，因此该位置为信号肽的剪切位点，AsLEC蛋白具有一段33个氨基酸残基的信号肽。从图7可以看出，在AsLEC 蛋白的N端第5～27位置处存在一个跨膜α螺旋（TMhelix）。综合以上信息，表明AsLEC蛋白为分泌型蛋白质，这与B-lectin蛋白的功能特点相吻合。

2.5  AsLEC系统进化树的构建

根据1.2.3中NCBI的blast结果，选取部分植物的lectin氨基酸序列以及另外三类lectin氨基酸序列，利用MEGA6和FigTree软件进行系统进化树构建，其中构建方法采用最大相似法，Bootstrap值为1000（图8）。进化树整体聚为星号 表示糖结合位点，不同颜色条带代表不同的亚结构模块。

四大类，其中HrLEC、MtLEC和RcLEC属于几丁质结合类植物凝集素，SeLEC和SnLEC2属于Ⅱ型核糖体失活蛋白类植物凝集素，DbLEC和UeLEC属于豆科类植物凝集素，而AsLEC和其他的蛋白质均属于单子叶甘露糖结合类植物凝集素，进一步验证了AsLEC基因的凝集素类别。

2.6  AsLEC蛋白亚细胞定位预测

2.7  AsLEC基因表达模式分析

对AsLEC基因在剑麻紫色卷叶病高抗和高感植株不同发病阶段进行表达模式分析，结果见图10。从图10中可以看出，与高感植株相比，AsLEC基因在剑麻紫色卷叶病高抗植株不同发病阶段中均呈现较高表达量，两者之间表达量最高可相差3.5倍，推测AsLEC基因在剑麻对紫色卷叶病抗性中起着重要作用。

3  讨论

本研究克隆获得AsLEC基因，通过功能结构域分析得出其具有B-lectin基因家族特有的典型特征序列，归为B-lectin（Bulb-type mannose-spe c fic lectin）基因家族。B-lectin基因家族为植物凝集素超家族重要的一员[14]，除了B-lectin（单子叶甘露糖结合凝集素家族）外，植物凝集素家族还包括葫芦科韧皮部凝集素家族、2-型核糖体失活蛋白家族、豆科类凝集素家族、木菠萝（Jacalin）凝集素家族、苋菜凝集素家族、几丁质结合凝集素家族[15]。与雪花莲、水仙、君子兰等植物的单子叶结合甘露糖凝集素家族相比，剑麻AsLEC单体蛋白除具有3个保守的亚结构域、每個亚结构域表面的缝隙中均存在一个相同的保守性甘露糖结合位点以及11个保守的折叠二级结构等这些单子叶结合甘露糖凝集素家族的共同特征外，还含有一些变异结构，如其N端明显多出5个氨基酸残基以及保守性的甘露糖结合区域也发生1个氨基酸残基的改变等。其中，甘露糖结合区域作为单子叶结合甘露糖凝集素基因发挥相关生物学功能所必不可少的结构成分，它的典型结构为：结合区域均位于每个凝集素蛋白的亚结构域表面缝隙处[16]，高度保守的Q-D-N-V-Y氨基酸残基通过氢键与甘露糖特异性结合，每个凝集素蛋白单体含有3个同样的位点，成熟的凝集素蛋白共有12个甘露糖结合位点[17]。然而在剑麻AsLEC蛋白中，其甘露糖结合区域中高度保守的Q-D-N-V-Y突变为Q-D-N-A-Y。推测这种变化为进化中碱基突变产生，此变化对于蛋白质结合甘露糖是否产生影响，尚有待进一步研究。

总之，单子叶甘露糖结合凝集素家族在多种植物中均存在，且在抗虫、抗病毒、免疫诱导以及入药[18-19]等方面发挥着重要作用。本研究克隆得到的剑麻AsLEC基因虽然在N端保守结构域和甘露糖特异结合位点处存在部分变异，但是其在总体机构上仍符合单子叶结合甘露糖凝集素家族的基本特征，且在剑麻紫色卷叶病高抗植株中呈现较高的表达量。然而这些结构的差异是否影响AsLEC基因在剑麻中行使正常的功能，这些尚不清晰，有待进一步研究。因此，本研究获得了剑麻AsLEC基因，对于后续研究其在剑麻中的功能奠定了重要基础。

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