LC/MSn法快速分析拉氧头孢钠原料的杂质谱

李进 姚尚辰 胡昌勤

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

杂质控制是药品质量控制的关键要素之一。人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)规定，应对表观含量高于0.1%的杂质进行定性研究[1]，欧洲医药管理局(EMA)则对发酵以及半合成来源的抗生素中的杂质限度进行了严格的要求[2]。随着中国正式成为ICH的成员国，严格按照ICH指南的要求进行新药和仿制药的杂质控制势在必行，这对中国药品的杂质控制水平也提出了新的挑战。近年来，随着色谱分离技术的发展，杂质控制的理念也由单纯的杂质限度控制发展到杂质谱控制。杂质谱分析可概况为杂质的分离、结构确证和毒性评估3部分，采用在线LC/MSn技术对药品中的杂质结构进行快速确证是目前杂质谱分析中最具有挑战的工作之一[3]。β-内酰胺类抗生素因其化学结构不稳定，容易发生降解反应，造成其杂质的种类和数量均明显高于其他类化学药品。因此，该类抗生素的杂质谱研究越来越受到关注。拉氧头孢钠属于第三代头孢菌素，是由日本盐野义制药有限公司研发生产的，该药物对多数革兰阴性菌具有抗菌作用，并且对β-内酰胺酶具有良好的耐受性，在临床上广泛使用。

查阅各国药典可知，美国药典41版、欧洲药典9.0版、英国药典2018年版均未收载该品种。日本药典XVI版[4]收载了该品种，在有关物质项下采用RPHPLC法进行等度洗脱，仅对1-甲基-5-巯基四氮唑和脱羧基拉氧头孢两个特定杂质进行了限度控制，其他杂质未进行质控；中国药典2015年版二部[5]也收载了该品种，采用HPLC法进行梯度洗脱，对最大单个杂质和总杂质进行了控制。查阅文献资料，国内外未见拉氧头孢钠的杂质谱研究的相关报道。因此，本文基于中国药典2015年版收载的有关物质色谱系统，采用LC/MSn技术对拉氧头孢钠原料中15种杂质进行了结构研究，推测出其中12种杂质的化学结构，其中10种杂质的结构为首次报道。12种杂质的化学结构参见图1 。

1 材料与方法

1.1 仪器

图1 拉氧头孢和12种杂质的推测结构式Fig.1 Structures of latamoxef and 12 impurities

HPLC-UV色谱系统由岛津LC-20A型液相色谱仪、PDA检测器组成，工作站为LC Solution(日本岛津公司)；LC-MS系统由岛津LC-20A色谱系统(包括二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱和PDA检测器)和Qtrap 6500型MS/MS质谱仪(美国ABsiecx公司)组成，工作站为Analyst 1.6版。

1.2 样品与试剂

拉氧头孢钠原料供试品(批号：3362)、脱羧基拉氧头孢对照品(批号：LP)由住商医药(上海)有限公司提供，巯甲基四氮唑对照品(批号：130617-201702)由中国食品药品检定研究院提供。

乙腈(色谱纯)购自美国Fisher公司，其他化学试剂(分析纯)，均购自国药集团化学试剂公司。水为实验室自制双蒸水。

1.3 RP-HPLC法

色谱柱：Shiseido TYPE UG80 C18(4.6mm×250mm,5μm)SN：AQAD02856；流动相：A相：0.01mol/L醋酸铵溶液-甲醇(99:1,V/V)；B相：0.01mol/L醋酸铵溶液-甲醇(70:30,V/V)。进行梯度洗脱：0～5.0min维持A相为99%，5.0～30.0min降低A相至50%，30.0～40.0min降低A相至0，40.0～50.0min维持A相为0，50.0～51.0min升高A相至99.0%。流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL；检测波长：254nm。用于分离分析拉氧头孢钠原料及强制降解溶液中的杂质。

1.4 LC/MSn法

因中国药典2015年版二部收载的有关物质色谱系统为醋酸铵-甲醇系统，可以直接用于LC/MSn分析，所以LC/MSn法所采用的高效液相色谱系统与RP-HPLC法所用系统一致。质谱方法：+EMS和+EPI的扫描范围：50～1000；Curtain Gas(气帘气)：20L/hr；IS(离子源电压)：+4500V；TEM(离子源温度)：500.00℃；GS1(吹扫气1)：60L/hr；GS2(吹扫气2)：65L/hr；CAD(碰撞活化解离能)：Medium(中级)；DP(解簇电压)：+150V；EP(入口电压)：+6.0V；CE(碰撞电压)：+30.00V；CES(扩展碰撞电压)：+15.00V。

1.5 溶液配制

拉氧头孢钠样品溶液(T-1)：取批号3362拉氧头孢钠原料适量，精密称定，置于50mL的量瓶中，加流动相A溶解并定容至刻度，制成含拉氧头孢约为1.0mg/mL的溶液，摇匀，过0.45μm的滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。

1.6 强力实验

取拉氧头孢钠原料，分别在酸性、碱性、高温、紫外、氧化等条件下进行降解实验。

酸降解溶液(T-2)：称取拉氧头孢钠约10mg，置于10mL量瓶中，加水2mL使溶解，加0.1mol/L盐酸溶液1mL，室温放置1h，用0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，用水稀释至刻度，备用。

碱降解溶液(T-3)：称取拉氧头孢钠约10mg，置于10mL量瓶中，加水2mL使溶解，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL，室温放置15min，用0.1mol/L盐酸溶液1mL中和，用水稀释至刻度，备用。

氧化降解溶液(T-4)：称取拉氧头孢钠约10mg，置于10mL量瓶中，加水2mL使溶解，加30%双氧水0.1mL，室温放置15min，用水稀释至刻度，备用。

高温降解溶液(T-5)：称取拉氧头孢钠约10mg，置于10mL量瓶中，110℃破坏1h，冷却后用水溶解并稀释至刻度，备用。

紫外(UV)降解溶液(T-6)：称取拉氧头孢钠约10mg，置于10mL量瓶中，紫外照射破坏12h，用水溶解并稀释至刻度，备用。

2 结果与讨论

2.1 RP-HPLC法分析拉氧头孢钠溶液中的杂质

采用中国药典2015年版收载的方法，对拉氧头孢钠的有关物质进行了HPLC分析，如图2所示。研究发现，该批原料中共检出15种杂质，杂质总量为4.22%，单个最大杂质为2.07%(Imp-13)。由生产工艺可知，该药物为半合成抗生素，根据EMA对半合成抗生素杂质的要求，当日给药剂量≤2g时，应对表观含量≥0.10%的杂质进行定性鉴别。在该样品中，共检出7种含量超过0.10%须进行结构鉴定的杂质，分别为Imp-1、Imp-5、Imp-9、Imp-10、Imp-11、Imp-13和Imp-15。虽然其他杂质含量低于EMA要求的定性限度，但是为了保证产品的质量，本文也尝试对这些微量的杂质进行结构研究。

2.2 强制降解实验结果

为了探索拉氧头孢钠原料中杂质的来源，根据头孢菌素类抗生素的降解反应机理，分别研究了拉氧头孢钠溶液，在酸性、碱性、氧化、高温、UV照射条件下，样品中有关物质的变化情况，参见图3。根据上述强制降解实验的结果，可以得知拉氧头孢钠中的Imp-1～2、Imp-5和Imp-13杂质为降解杂质。

2.3 拉氧头孢钠质谱裂解途径分析

图3 供试品溶液在不同降解条件下的典型色谱图Fig.3 Typical chromatograms of sample degradation solutions

分析拉氧头孢钠的质谱裂解途径，获取该药物的特征性质谱碎片，有助于杂质的质谱数据解析。将拉氧头孢钠原料约2mg，用甲醇/水(1:1，V/V)溶液稀释至50μg/mL，采用流动注射法进样，通过多级质谱推测在正离子模式下拉氧头孢钠的质谱裂解途径。图4-a1显示了拉氧头孢钠的一级质谱峰，图4-a2中显示了m/z521.1的[M+H]+峰的一系列的碎片离子，图5对拉氧头孢钠二级质谱中的12个碎片峰进行了合理的推断，为杂质的质谱分析提供了依据，具体质谱数据参见表1。

2.4 强制降解实验产生杂质的LC/MSn分析

2.4.1 杂质Imp-1,2

图4 拉氧头孢钠及12种杂质的+EMS(1)及+EPI(2)质谱图Fig.4 +EMS(1)and +EPI(2)spectra of latamoxef sodium and its impurities

图5 拉氧头孢推测质谱裂解途径Fig.5 Mass fragmentaion pathway of latamoxef

表1 拉氧头孢和12种杂质的质谱数据列表Tab.1 mass spectra data of Latamoxef and 12 related impurities in raw material

Imp-1在水浴降解过程中含量增加。Imp-1的+EMS图(图4-b1)中存在m/z423.1、445.1的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+峰，推测Imp-1的分子量为422.1，比拉氧头孢的分子量520少98。二级质谱图(图4-b2)中未检出[M+H-116]+的特征碎片峰，表明杂质Imp-1的3位侧链中不含有巯甲基四氮唑；存在m/z391.0[M+H-32]+的碎片离子峰，说明7位的甲氧基未变化；存在m/z347.0[m/z391-44]+的碎片离子峰，说明母核的羧基未发生变化，存在m/z151.1的碎片离子峰，说明7位侧链的羧基未发生变化。根据头孢菌素类抗生素的降解反应规律，在碱性条件下易水解脱掉三位侧链，形成三位侧链水解产物。

杂质Imp-2的一级和二级质谱图均与杂质Imp-1基本一致(图4-b1～b2)，说明二者互为同分异构体。由于拉氧头孢7位侧链上的手性碳具有R构型和S构型，拉氧头孢主峰在色谱图中表现为两个主峰，所以推测杂质Imp-2和Imp-1是一对因7位侧链手性碳构型不同而形成的异构体。杂质Imp-1～2的化学结构式参见图1，质谱裂解途径参见图6。

2.4.2 杂质Imp-5

Imp-5在水浴、酸、碱降解过程中含量增加。Imp-5的+EMS图(图4-e1)中存在m/z117.0的准分子离子峰，为[M+H]+峰，推测Imp-5的分子量为116.0，与3位侧链巯甲基四氮唑的分子量一致。该杂质的色谱保留时间与巯甲基四氮唑对照品的保留时间一致(图2c)，因此，推断杂质Imp-5为巯甲基四氮唑。化学结构式参见图1。

2.4.3 杂质Imp-13

Imp-13在高温降解过程中含量增加。Imp-13的+EMS图(图4-i1)中存在m/z477.1、499.1及514.9的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰，推测Imp-13的分子量为476.1，比拉氧头孢钠分子量少44，提示分子中少了一个羧基。二级质谱(图4-i2)中存在m/z361.0[M+H-116]+的碎片离子峰，说明3位侧链为巯甲基四氮唑；存在m/z199.0的碎片离子峰，说明母核未发生变化；因此推测7位侧链失去了游离的羧基，形成了拉氧头孢钠脱羧物。将该杂质的色谱保留时间与脱羧基拉氧头孢钠对照品一致(图2b)，同时，二者的UV光谱图基本一致(图8c～d)。因此可以确证杂质Imp-13为脱羧基拉氧头孢。化学结构式参见图1，质谱裂解途径见图7，UV光谱图参见图8c～d。

2.5 其他杂质的LC/MSn分析

图6 Imp-1,2的推测质谱裂解途径Fig.6 Mass fragmentaion pathway of imp-1,2

图7 Imp-13的推测质谱裂解途径Fig.7 Mass fragmentaion pathway of imp-13

图8 杂质Imp-10，11和13与脱羧基拉氧头孢钠的典型UV光谱图Fig.8 Typical UV spectra of impurities Imp-10,11 and 13 and sodium decarboxylatamoxef STD

强力降解实验中，拉氧头孢钠中有11个杂质未见明显增加，通常它们被认为是工艺杂质，但也可能是特定条件下的降解产物。利用LC/MSn方法推测出的可能结构，应结合具体的合成工艺进行必要的验证。由于杂质Imp-6,7,8 3种杂质含量非常低，没能得到理想的质谱图，本文无法对其结构进行推测。

2.5.1 杂质Imp-3

Imp-3的+EMS图(图4-c1)中存在m/z422.0、444.1及466.0的准分子离子峰，分别为Imp-3的[M+H]+、[M+Na]+和[M-H+2Na]+峰，推测Imp-3的分子量为421.0，比拉氧头孢的分子量520少97，比Imp-1的分子量少1，提示该杂质为Imp-1的结构类似物。二级质谱图(图4-c2)中未检出[M+H-116]+的特征碎片峰，表明杂质Imp-3的3位侧链中不含有巯甲基四氮唑；存在m/z390.0[M+H-32]+的碎片离子峰，说明7位的甲氧基未变化；存在m/z151.1的碎片离子峰，说明7位侧链的羧基未发生变化；存在m/z346.0[m/z390-44]+说明母核上的羧基未发生变化。为了进一步推断化学结构，将该杂质与杂质Imp-1的二级质谱数据进行比较，发现Imp-3的二级质谱图中存在m/z212.0的碎片离子峰，比Imp-1的m/z213.0的碎片离子峰少1，但两个杂质均存在m/z169的碎片离子，因此推测杂质Imp-3的2位羧基变为酰胺基团，同时3位侧链水解，化学结构式参见图1。裂解途径参见图9。

2.5.2 杂质Imp-4

Imp-4的+EMS图(图4-d1)中存在m/z379.1、401.1的准分子离子峰，分别为Imp-4的[M+H]+、[M+Na]+峰，即Imp-4的分子量为378.1，比拉氧头孢的分子量520少142，比Imp-1的分子量少44，提示该杂质为Imp-1的脱羧基产物。二级质谱图(图4-d2)中未检出[M+H-116]+的特征碎片峰，表明杂质Imp-4的3位侧链中不含有巯甲基四氮唑；存在m/z347.0[M+H-32]+的碎片离子峰，说明7位的甲氧基未变化；未见7位羧基的特征离子m/z151(参见“2.4.1”项杂质Imp-1,2)，说明7位侧链中不含有羧基，因此推测该杂质为脱羧基拉氧头孢的3位水解产物。化学结构式见图1，裂解途径见图10。

2.5.3 杂质Imp-9

Imp-9的+EMS图(图4-f1)中存在m/z437.2、459.0和481.0的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+及[M-H+2Na]+峰，即Imp-9的分子量为436.2。二级质谱(图4-f2)中未检出[M+H-116]+的特征碎片峰，表明杂质Imp-9的3位侧链中不含有巯甲基四氮唑；存在m/z405.1[M+H-32]+以及m/z373.0[m/z405-32]+的碎片离子峰，说明该杂质的化学结构中含有2个甲氧基，除了母核7位的甲氧基外还有一分子的取代甲氧基；因3位侧链不含有巯甲基四氮唑，故推测另一个甲氧基取代位置在3位侧链上。存在m/z361.1[m/z405-44]+的碎片离子峰，说明母核上存在羧基，存在m/z151的羧基特征碎片离子，说明7位侧链存在取代羧基，未发生变化；存在m/z227.2的碎片离子峰，说明母核未发生变化。综上分析，杂质Imp-9为3位侧链甲氧基取代的拉氧头孢。化学结构式参见图1，特征碎片的裂解途径参见图11。

2.5.4 杂质Imp-10,11

Imp-10的+EMS图(图4-g1)中存在m/z405.1、427.1及442.9的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+峰，即Imp-10的分子量为404.1,与拉氧头孢钠脱3位侧链的碎片离子m/z405.1分子量相同。二级质谱(图4-g2)中未检出[M+H-116]+的特征碎片峰，表明杂质Imp-10的3位侧链中不含有巯甲基四氮唑；存在m/z373.0[M+H-32]+碎片离子峰，说明7位甲氧基未发生变化，存在m/z151.0碎片离子峰，说明7位侧链羧基未发生变化，存在m/z199的碎片但未检出m/z155[m/z199-44]+的碎片，说明母核结构中羧基发生了改变，因此推测3位侧链脱去巯甲基四氮唑后与2位的羧基脱水成内酯。

图9 Imp-3的推测质谱裂解途径Fig.9 Mass fragmentaion pathway of imp-3

图10 Imp-4的推测质谱裂解途径Fig.10 Mass fragmentaion pathway of imp-4

图11 Imp-9的推测质谱裂解途径Fig.11 Mass fragmentaion pathway of imp-9

Imp-11的质谱图与杂质Imp-10基本一致，二者色谱保留时间相近，UV光谱图基本一致，因此推测二者均为拉氧头孢内酯，互为同分异构体，异构化位点与拉氧头孢相同。杂质Imp-10,11的化学结构参见图1，质谱裂解途径见图12，UV光谱图参见图8a～b。

2.5.5 杂质Imp-12

Imp-12的+EMS图(图4-h1)中存在m/z361.1、383.0及399.0的准分子离子峰，分别为的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰，即Imp-12的分子量为360.1，比拉氧头孢内酯分子量m/z405.1少44，初步推测为拉氧头孢内酯脱羧物。二级质谱(图4-g2)中未检出[M+H-116]+的特征碎片峰，表明杂质Imp-12的3位侧链中不含有巯甲基四氮唑；存在m/z199碎片但未检出m/z155[m/z199-44]+的碎片，说明母核结构中羧基发生了改变，因此推测该杂质的母核部分为内酯结构。存在m/z329.0[M+H-32]+的碎片离子峰，说明7位甲氧基未变化，不存在m/z151.0碎片离子峰，说明7位侧链没有羧基。综上分析推测杂质Imp-12为拉氧头孢钠内酯脱羧物，化学结构式参见图1，质谱裂解途径参见图13。

2.5.6 杂质Imp-14

Imp-14的+EMS图(图4-j1)中存在m/z535.1、557.0及579.1，分别为[M+H]+、[M+Na]+和[M-H+2Na]+峰，即Imp-14的分子量为534.1，比拉氧头孢分子量多14，即多一个甲基。二级质谱(图4-j2)中m/z419.0[M+H-116]+碎片离子峰，说明3位侧链为巯甲基四氮唑，未发生变化；存在与拉氧头孢相同的m/z199.0和155.0的碎片离子峰，说明母核未发生变化，存在m/z359.0[m/z391.0-32]+碎片离子峰，说明7位甲氧基未发生改变；因此多出的甲基位于7位侧链上，初步推测为苯环上的羟基取代为甲氧基，化学结构参见图1，质谱裂解途径参见图14。该取代位点需要进一步研究。

2.5.7 杂质Imp-15

图12 Imp-10,11的推测质谱裂解途径Fig.12 Mass fragmentaion pathway of imp10,11

图13 Imp-12的推测质谱裂解途径Fig.13 Mass fragmentaion pathway of imp-12

图14 Imp-14的推测质谱裂解途径Fig.14 Mass fragmentaion pathway of imp-14

Imp-15的+EMS图(图4-k1)中存在m/z535.1、557.0及579.1，分别为[M+H]+、[M+Na]+和[M-H+2Na]+峰，即Imp-15的分子量为534.1，比拉氧头孢分子量多14，即多一个甲基，与杂质Imp-14为同分异构体。二级质谱(图4-k2)中存在m/z419.0[M+H-116]+碎片离子峰，说明3位侧链为巯甲基四氮唑，未发生变化；存在m/z359.0[m/z391.0-32]+碎片离子峰，说明7位甲氧基未发生改变；不存在拉氧头孢母核的m/z199.0和155.0特征性碎片离子峰，但存在m/z213.2[m/z199+14]+的碎片离子，说明母核上发生甲基取代。由于存在m/z391[m/z419-28]+碎片离子，说明四元内酰胺环未开环，因此推测为母核上的羧基被取代成为羧酸甲酯。化学结构参见图1，质谱裂解途径参见图15。

2.6 中国药典质量标准评价

图15 Imp-15的推测质谱裂解途径Fig.15 Mass fragmentaion pathway of imp-15

通过以上的强制降解实验和LC/MSn法分析降解杂质和工艺杂质的化学结构，可见中国药典2015年版的有关物质方法能够检出拉氧头孢钠中的多种降解杂质和工艺杂质。前期的高效凝胶色谱研究表明拉氧头孢钠原料中含有二聚体杂质，但是本次研究未检出拉氧头孢钠聚合物杂质，因此药典方法对聚合物杂质的检出能力有待于进一步优化提高。

3 结论

本文以LC/MSn法为主要技术手段，对拉氧头孢钠原料中的15种杂质开展了结构分析。综合运用强力试验和头孢菌素类抗生素的降解反应机理，快速鉴定出12种杂质的化学结构，其中4种杂质可以通过强制降解实验得到，12个杂质中10种杂质的结构为首次报道。通过杂质谱的研究发现中国药典有关物质方法对聚合物杂质的检出能力有待于进一步提高。