解脲支原体临床分离株生物被膜药物敏感性分析

王欣 何来鹏 吴志毅 钟琼 曾今成 杨维青,*

(1 广东医科大学基础医学院，湛江 523000；2 广东医科大学医学附属医院，湛江 524001；3 广东医科大学第二临床学院，东莞523808；4 广东医科大学检验医学研究所东莞市医学活性分子开发与转化重点实验室，东莞 523808)

解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)是寄居在成年女性生殖道的正常微生物群，女性生殖道内微环境紊乱时常会引起妇科炎症，该菌还可通过胎盘感染胎儿而导致早产、死胎，或在分娩时感染新生儿[1]。近年来，由于支原体感染及临床抗菌药物的广泛使用，导致支原体的耐药状况较为普遍[2-3]。国外文献报道支原体可形成生物被膜，生物被膜的形成可降低其对药物的敏感性[4-8]，国内的相关报道不多。本研究对临床分离的解脲支原体进行生物被膜形成能力分析，并检测其在生物被膜状态下的药物敏感性变化，为解脲支原体的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

四环素、红霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素标准品(上海紫一试剂厂产品)，按药物特性溶解原药，过滤除菌后，将药物稀释为5120mg/L，置于-20℃冰箱保存备用。Uu液体选择性培养基为珠海迪尔生物工程公司产品。

1.2 菌株来源和分离及鉴定

25株Uu临床菌株，取2016年9月—2017年9月广东医科大学医学附属医院门诊妇科疾病的女性患者阴道分泌物标本，使用Uu分离培养试剂盒对标本进行Uu的培养和初步鉴定；采用固体培养法进行分离：将阳性Uu培养物用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液转种于A7琼脂培养基培养，待培养基由淡浅黄色变成淡紫色时，在显微镜下观察，若有黑褐色海胆样菌落生长，判为Uu阳性；挑取单个菌落接种Uu液体培养基培养，待培养基变为橙红色时加入灭菌甘油，置于-70℃冰箱保存备用。

1.3 Uu菌株生物被膜形成能力分析

参考文献方法[9]对25株Uu临床菌株进行生物被膜培养。将Uu菌株接种液体培养基，5% CO2温箱中37℃培养至对数期，收获菌株。用支原体培养基将菌液终浓度调为104CCU/mL(104～105CFU/mL)，接种于96孔细胞培养板，阴性对照孔为培养基，每孔加入两滴无菌石蜡油。常规培养，每隔24h进行换液，培养72h。吸弃培养液，用无菌PBS轻轻冲洗，除去浮游菌。每孔加入0.5%结晶紫染液1mL，染色20min，用无菌PBS冲洗。每孔加入1mL无水乙醇，脱色10min；用酶标仪测定结晶紫析出液在560nm波长处的吸光值(A560)；每个试验设3个复孔，取平均值。

1.4 Uu菌株生物被膜药物敏感性检测

1.4.1 Uu菌株在浮游状态下的药物敏感性检测

采用微量稀释培养法进行药敏试验。将四环素、红霉素、左氧氟沙星、阿奇霉素进行倍比稀释；对Uu菌株培养液进行计数并调节菌液浓度，等量加入不同浓度的药物中，设不加药物的对照孔，菌液的终浓度为104CCU/mL，药物的终浓度为0.0625～64mg/L。每孔滴加无菌液体石蜡。37℃恒温箱中孵育48h后观察结果，待对照孔培养基发生颜色改变时，读取药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)，以无颜色变化孔的最低药物浓度定为MIC，耐药、敏感的判读标准参考珠海迪尔生物工程公司支原体分离培养药敏试剂盒(表1)。试验重复3次，取平均值。

1.4.2 Uu菌株在生物被膜状态下的药物敏感性检测

参照文献[6]方法检测Uu菌株在生物被膜状态下的药物敏感性。使用96孔细胞培养板培养Uu菌株生物被膜，分别在每个孔中加入200μL液体培养基及Uu菌株菌液(菌液终浓度浓度为104CCU/mL)，每孔滴加无菌液体石蜡，置于37℃恒温箱培养，每24h用液体培养基进行换液，培养至48h。用微量吸液器吸弃培养液，用PBS溶液轻轻冲洗3次。每孔加入200μL含有不同浓度抗生素的培养基，对照孔不加抗生素。药物的终浓度为0.0625～64mg/L。继续培养至对照孔培养基出现颜色变化，此时读取最小生物被膜药物抑制浓度(minimal biof ilm inhibitory concentration,MBIC)。试验重复3次，取平均值。

1.4.3 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件，采用配对秩和检验及χ2检验分别比较Uu菌株在浮游状态下MIC和在生物被膜状态下MBIC及其耐药率间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 解脲支原体药物敏感性判读标准(mg/L)Tab.1 Sensitivity standard for drug dilution for U.urealyticum

2 结果

2.1 Uu菌株的生物被膜形成能力

参考文献[9]方法将A560≤0.15者定为无生物被膜形成，A560＞0.15者为有生物被膜形成。在所检测的25株Uu中，16株Uu生物被膜培养物的结晶紫析出液在560nm波长处的吸光值A560＞0.15，参考文献[9]方法确定为有生物被膜形成，阳性率为64%(16/25)；9株Uu生物被膜培养物的结晶紫析出液在560nm波长处的吸光值A560≤0.15者，定为无生物被膜形成(图1)。

2.2 Uu 菌株在浮游状态下和生物被膜状态下的药物敏感性比较

16株能生物被膜形成的Uu菌株，其在浮游状态和在生物被膜培养状态下对所选4种抗生素的体外药敏试验结果见表2～3。结果显示：绝大多数Uu临床菌株在生物被膜形成后对四环素和左氧氟沙星MBICs，较其浮游状态下MICs增加约4～8倍或以上，差异有统计学意义(P＜0.05)，对红霉素和阿奇霉素MBICs增加0～2倍，差异有统计学意义(P＜0.05)；依据Uu稀释法药物敏感性判读标准，Uu临床菌株在生物被膜形成后对四环素、左氧氟沙星的耐药率显著提高，差异有统计学意义(P＜0.05)；对红霉素、阿奇霉素耐药率的差异无统计学意义(P＞0.05)。

9株形成不能生物被膜的Uu菌株，在浮游状态和生物被膜培养状态下对所选4种抗生素体外药敏试验的MIC和MBIC值略有增加，二者的差异无统计学意义(P＞0.05)；对所选4种抗生素耐药率的差异亦无统计学意义(P＞0.05)(具体数据略)。

3 讨论

图1 Uu生物被膜培养物结晶紫染色(放大倍数：10×60)Fig.1 Biof ilm of Uu strains(magnification:10×60)

表2 16株Uu的MIC与MBIC结果(mg/L)Tab.2 The MIC and MBIC of 16 U.urealyticum isolates(mg/L)

表3 Uu在浮游状态与生物被膜状态下的耐药率Tab.3 The drug resistance rate of U.urealyticum isolates in fl oating and biof ilm state

多数细菌在机体内可形成生物被膜，与液相单个生长的浮游菌相比，生物被膜细菌群体对抗生素表现出高度的不敏感和较强的免疫逃逸能力[4,10]。研究表明，细菌在生物被膜状态下对药物的MBICs与浮游状态下的MICs值存在较大差距，两种状态下对抗菌药物的敏感性不完全相同[4,10]。Uu可借助自身分泌的黏附素与宿主细胞表面的黏附素受体结合固着在机体细胞表面形成生物被膜[4]。本研究在所检测的Uu临床分离株中有64.0%可行形成生物被膜，Uu生物被膜对药物敏感性的变化值得关注。

本研究选择Uu临床治疗常用的3大类抗菌药物中的4种：四环素、红霉素、阿奇霉素和左氧氟沙星，进行Uu临床菌株生物被膜状态下的MBICs检测。不能形成生物被膜的Uu菌株，在浮游状态和生物被膜状态培养下对所选4种抗生素体外药敏试验的MIC和MBIC值略有增加，二者的差异无统计学意义，对所选4种抗生素耐药率的差异亦无统计学意义。而绝大多数能形成生物被膜的Uu菌株在生物被膜形成后对四环素和左氧氟沙星MBICs显著高于其浮游状态下MICs，其耐药率显著提高。对红霉素和阿奇霉素MBICs增加无差异有统计学意义。Uu生物被膜形成后对阿奇霉素的抑菌浓度虽有所提高，但还没有达到耐药的标准，所以对阿奇霉素仍是敏感的；生物被膜形成后多数支原体表现出对2种或3种药物的同时耐药的现象。关于Uu生物被膜形成后对四环素和左氧氟沙星的耐药率显著提高，以及表现出多重耐药的结果，与关于相关报道一致[5,7-8]。

细菌生物被膜形成后对不同种类抗菌药物敏感性的变化，一方面与生物被膜菌的特性有关，另一方面与药物的化学特性、抗菌机制有关[8,10-11]。成熟生物被膜菌群某些基因的表达和表型与浮游菌不同，这些变化可能形成新的变种，有些与提高菌体的抗性有关，如大量胞外多糖的产生和聚集，减低了抗菌药物的渗透；生物被膜内中营养物质和氧分压的降低，使被膜内部的菌体的代谢活性和生长速度下降，使菌体对药物敏感性降低；群体感应系统的激活进而调节某些基因的活化或抑制等，如与耐药相关的基因的高表达等。在抗菌药物方面，喹诺酮类药物虽然对细菌生物被膜有较好的渗透性[5]，但该类药物的抗菌机制干扰细菌DNA的复制，是繁殖期抑菌剂，而生物被膜菌代谢缓慢、繁殖速度下降，因此Uu在生物被膜状态下对左氧氟沙星这类喹诺酮类药物敏感性下降。四环素和红霉素都为静止期抑菌剂，但因分子量较大，不易进入生物被膜的基质内，同时细菌对二者的MIC值与该药在体内的治疗浓度的下限即敏感折点较接近，因此不难解释生物被膜形成后细菌对其表现出耐药的现象。本研究中Uu形成生物被膜后仍表现出对阿奇霉素敏感，与Pandelidis等[7]的研究结果类似。阿奇霉素与红霉素同属于大环内酯类药物，本研究结果中Uu生物被膜状态下对阿奇霉素仍是敏感的，其中的原因可能是：大多数Uu对阿奇霉素的MIC与该药在体内的治疗浓度的下限即敏感折点差距较远，而Uu对红霉素MIC与该药敏感折点差距很近，同时阿奇霉素有具有良好的抗生素后效应。关于Uu生物被膜对药物的敏感性下降的机制还待进一步研究。

目前，国内医院对Uu的药敏试验是针对浮游菌进行的，而多数支原体具有形成生物被膜的能力。因此，如不考虑Uu在感染机体易形成生物被膜的特性，只依据传统方法测得的MIC指导临床抗菌药物的使用，对Uu生物被膜菌感染很难达到满意的疗效。为提高Uu的临床治疗效果，在临床实践中，一方面在进行Uu药敏试验的同时，应该对Uu菌株生物被膜形成能力进行检测；另一方面，当依据传统药敏试验结果进行Uu抗菌药物治疗效果欠佳时，有必要考虑Uu生物被膜形成的可能，选用对生物被膜敏感的抗菌药物。