果酒中二氧化硫、非酚类和酚类物质抗氧化能力的研究

薄慧杰 张爱华 潘 勇 曾令文

（常州大学城乡矿山研究院，江苏常州 213164）

食品添加剂二氧化硫（SO2）是食品和饮料行业中最常用的抗氧化剂之一。SO2在果酒中主要以游离和结合这两种形式存在，两者的含量之和为总SO2含量。它具有抗氧化、杀菌和防腐能力。

果酒中含有少量非酚类抗氧化物质，如抗坏血酸、脱氢抗坏血酸和谷胱甘肽等，具有抗氧化作用。抗坏血酸是水果中广泛存在的主要天然抗氧化成分之一。抗坏血酸极易失去电子和氢离子，形成不稳定的中间体化合物脱氢抗坏血酸，所以果酒中含有少量的脱氢抗坏血酸。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，由于半胱氨酸上的巯基为其活性基团，是人体抗氧化系统中极其活跃的抗氧化物质。这些非酚类抗氧化物质通常和酚类化合物一起存在，在果酒中起抗氧化剂作用。

酚类物质是芳香环上连有多个或一个羟基的低分子量有机化合物，种类繁多，根据碳环结构的不同，可将其分为类黄酮和非类黄酮物质。总黄酮是指物质中各类黄酮化合物的总含量。黄酮类化合物中含有柚皮苷和少量野漆树苷，具有抗菌消炎、增强机体免疫力、提高抗氧化能力、延缓衰老、调节代谢机能等作用。酚类物质对果酒的抗氧化活性以及颜色和口感的影响至关重要。

抗氧化能力（AOC）是影响果酒品质的一个重要因素。果酒的氧化褐变严重影响果酒的品质，多酚氧化酶（PPO） 和过氧化物酶（POD） 是引起果酒酶促氧化褐变的关键酶。多酚氧化酶是一种含铜氧化酶，可将多酚氧化为醌，醌类物质发生聚合会产生类黑色素。过氧化物酶可促进酚类物质和蛋白质反应产生沉淀。通过添加适量抗氧化剂可以抑制果酒的氧化褐变，提高果酒的品质。通常在酿造过程中添加SO2作为抗氧化剂。

由于果酒中SO2对AOC的作用大小尚未确定，需要区分SO2、非酚类抗氧化物质和酚类物质对果酒总体抗氧化作用的强弱。酚类物质通常对果酒的抗氧化性有增强作用，因此福林酚（FCR）法测定总酚含量可以作为果酒抗氧化性强弱的一个指标。本研究针对这一问题进行一系列测定，最终分别确定它们对果酒总抗氧化作用的大小。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料

葡萄酒：葡萄品种，白露莎，产于江苏句容；蓝莓酒：蓝莓产于江苏省溧水；杨梅酒：杨梅产于江苏省溧阳市日日春庄园；水蜜桃酒：水蜜桃品种为湖景，产于江苏省无锡市洛社镇桃源圣境果园基地；宣木瓜酒：宣木瓜产于安徽省宣城市广德县四合乡；火龙果酒：火龙果购于江苏省常州市凌家塘市场；本研究使用的果酒全部由常州大学中澳果酒研发中心酿造。

参考国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，对6种果酒中总SO2、游离SO2、pH、滴定酸和酒精度进行测定，每个样品重复测定3次，测定结果见表1。

1.1.2 试验试剂

无水乙醇，99.7%分析纯，常州市润友商贸有限公司；酒石酸，食品级；偏重亚硫酸钾（PMS），食品级；福林酚试剂，常州市润友商贸有限公司；无水碳酸钠，99.8%分析纯，常州市润友商贸有限公司；乙醛，99.5%，5.0 mol/L，萨恩化学技术有限公司；交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP），常州市润友商贸有限公司。

1.1.3 试验仪器

PHS-25型数显pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；722N分光光度计，上海仪分科学仪器有限公司生产；LCMS2020液相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 SO2的测定方法

原理：SO2的测定方法为氧化法，样品中SO2通过循环真空泵进入接收瓶，然后H2O2和SO2反应，生成H2SO4，再用NaOH标准溶液中和滴定H2SO4，计算SO2的含量。

游离SO2含量测定：调节流速为1 L/min，移去双口接收瓶，通过侧壁加入10 mL，0.3%的H2O2，3-4滴甲基红—亚甲基蓝混合指示剂，然后滴加0.01 mol/L的NaOH，直至溶液呈现橄榄绿色，并且保持30 s不变色，记下所消耗NaOH体积，计算游离SO2的含量。

结合SO2含量测定：连接好接收瓶，给圆底烧瓶加10 mL、25%的H3PO4、用移液管移取20 mL待测酒液至圆底烧瓶，连接装置，在真空条件下蒸馏样品，流量1 L/min，反应15 min，反应结束后取下双口接收瓶，用0.01 mol/L的NaOH滴定至橄榄绿色，记下所消耗NaOH体积，计算结合SO2的含量。每个样品重复测定3次。12.2pH值和滴定酸的测定

取烧杯加入适量待测样品，使其能浸没电极，用pH计电极插入烧杯样品中，记录pH值。利用酸碱中和原理，用NaOH标准滴定溶液滴定样品中的有机酸，以pH=8.2为电位滴定终点，由NaOH标准滴定溶液体积可以计算出样品总酸含量。每个样品重复测定3次。

1.2.3 酒精的测定方法

依据GB5009.225《食品安全国家标准 食品中二氧化硫的测定》测定。

1.2.4 果酒抗氧化活性分析方法

1.2.4.1 抗氧化能力的测定

采用福林酚（FCR）方法来测定果酒的抗氧化能力。将0.5 mL样品与2.5 mL稀释10倍的FCR混合并使其反应5 min，向混合物中加入2 mL75 g/L的NaCO3溶液，混匀，在室温下反应2 h后，测量其在760 nm处的吸光度。使用没食子酸溶液制备标准曲线，并计算回归方程。结果表示为没食子酸当量的毫克数（mgGAE/L）。每个样品重复测量3次。

1.2.4.2 SO2对果酒的抗氧化增强效应

国家标准中规定葡萄酒中SO2最大使用量为250 mg/L，过量的SO2不仅影响果酒的品质而且会刺激人体消化道黏膜，长期摄入还会对肝脏和肾脏造成损害。将样品中总SO2含量调整到22 mg/L～224 mg/L范围内，测定它们在各个水平下的总酚含量。为了测出SO2对果酒抗氧化性的增强效果，在稀释前用质量浓度为1000 mg/L的乙醛对样品进行处理，游离SO2与乙醛形成醛桥，使SO2含量减少，测定此时样品中总酚含量。加入乙醛前后测定的总酚含量差值即为SO2对果酒的抗氧化增强效应。

1.2.4.3 非酚类化合物的抗氧化能力

PVPP分子内含有可形成氢键的N、O原子，多酚分子中含有至少一个活性氢，可以与PVPP形成氢键。由于PVPP不溶于水，多酚分子就通过氢键不断沉积到PVPP分子链上而被除去。参考Bridi的方法使用PVPP对样品进行3次预处理以除去酚类化合物，将 PVPP（100 mg） 加入 1 mL酒样中，搅拌30 s，将样品在室温下以13000 r/min离心5 min，取上清液0.7 mL加入70 mgPVPP，搅拌均匀并离心，再取上清液0.5 mL加入50 mg PVPP，搅拌均匀并离心。此时用FCR方法测定上清液的总酚含量即可表示为非酚类化合物的抗氧化能力。

1.2.4.4 总黄酮含量的测定

使用Bursac等的方法测量总黄酮含量。将0.5 mL不同质量浓度的儿茶素标准溶液中依次加入2 mL去离子水，0.15 mL5%的NaNO2溶液，混匀静置5 min，加入0.15 mL 10%的AlCl3溶液，混匀静置1 min，加入1 mL 1mol/L的NaOH溶液，用去离子水定容至5 mL，混匀。以去离子水为空白对照，在510 nm的波长下测定吸光度，每个标准溶液的测定重复3次。以儿茶素的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。取0.5 mL样品，按标准曲线的制作方法测定样品的吸光度，根据线性回归方程计算样品中总黄酮含量。样品中总黄酮的含量以当量的儿茶素质量浓度（mgCAE/L） 来表示，每个样品重复测定3次。

1.2.4.5 非酚类抗氧化剂含量的测定

通过高效液相色谱（HPLC）测量非酚类抗氧化剂的含量。HPLC因其高效、高速且高度灵敏性而受到广泛应用。采用杨媛、杜梨梨等的方法，用偏磷酸提取酒样中的抗坏血酸和脱氢抗坏血酸。使用液相色谱-质谱联用仪，采用C18色谱柱分离，以甲醇-磷酸盐缓冲溶液（pH 3.5） 为流动相，在245 nm下检测。同时用HPLC标准曲线法进行酒样中还原型和氧化型谷胱甘肽含量测定的方法，用IntersilODS-3 C18柱，以庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液 （pH 3.0） 和甲醇 （V∶V=90∶10） 为流动相，流速为1.0 mL/min，在210 nm下检测，用外标法进行定量分析。

1.2.5 统计学分析方法

T检验是用于小样本（样本容量小于30）的2个平均值差异程度的检验方法，它使用T分布理论来推断差异发生的概率，从而判定2个平均数的差异是否显著。本研究主要用统计产品与服务解决方案（SPASS） 软件进行T检验来检测6种水果中SO2、非酚类抗氧化物质和酚类物质对果酒总抗氧化性的作用是否存在显著差异。

2 结果与讨论

本研究使用FCR方法来评估SO2、非酚类抗氧化物质和酚类物质对果酒总体抗氧化性强度的影响。

2.1 不同SO2含量对果酒总抗氧化能力的影响

针对白色果酒和红色果酒，随着偏重亚硫酸钾（PMS）添加量的增加，6种果酒和标准样品中SO2含量也随之增加，各种果酒中总SO2含量测定结果见表2。

添加不同含量的PMS于标准样品和果酒中。由于不同果酒的结合强度不同，所以呈现出不同水平的总SO2含量（表2），但都控制在22 mg/L～224 mg/L范围内，再使用FCR方法测定不同含量总SO2对不同果酒的抗氧化特性影响，结果如图1、图2所示。

图1 不同总SO2含量下测定不同果酒的总酚含量

图2 不同总SO2含量下测定红色果酒的总酚含量

图1和图2分别显示的是白色果酒和红色果酒在不同总SO2含量下的总酚含量。由图1、图2可知，总SO2含量在22 mg/L～224 mg/L范围时，6种果酒随着SO2含量的增加，其总酚含量也随之增加。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的线性回归方程分别为y=1.385x+87.454、R2=0.9754，y=0.5111x+219.43、R2=0.9806，y=0.6976x+1642.8、R2=0.9942。根据其线性回归方程的截距可推算出在不人为添加SO2情况下，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的总酚含量分别为87.45 mgGAE/L、219.43 mg GAE/L和1642.80 mg GAE/L，当其总SO2含量为200mg/L时，其总酚含量为364.45mgGAE/L、321.65 mgGAE/L和1782.32 mgGAE/L。在红色果酒中，蓝莓酒、杨梅酒和火龙果酒的线性回归方程分别为 y=5.754x+1164、R2=0.9964，y=0.4766x+966.9、R2=0.9972，y=0.8015x+388.69、R2=0.9926。根据其线性回归方程的截距可推算出在不人为添加SO2情况下，蓝莓酒、杨梅酒和火龙果酒的总酚含量分别为1164.00 mg GAE/L、966.90 mg GAE/L和407.65mgGAE/L。当其总SO2含量为200mg/L时，其总酚含量为2314.80mgGAE/L、1062.22mgGAE/L和548.99 mgGAE/L。由此SO2对果酒抗氧化性的增强效应得到验证。

表2 不同果酒不同水平下的总SO2含量

2.2 SO2对果酒总抗氧化能力的影响

Somers和Ziemelis指出添加足够量的乙醛可以完全结合存在的游离SO2以防止总酚含量的增加。向样品中加入1000 mg/L的乙醛可消除SO2的增强效应。在室温下加入乙醛反应约30 min后，测定不同总SO2含量下不同果酒的总酚含量，结果如图3、图4。

由图3、图4可知，在添加乙醛去除游离SO2后，不管是白色果酒还是红色果酒，其总酚含量都在减少。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的线性回归方程分别为y=0.6997x+109.06、R2=0.9614， y=0.3633x+208.88、 R2=0.9889， y=1.9456x+1016.8、R2=0.9743。根据其线性回归方程计算出当其总SO2含量为200 mg/L时，其总酚含量分别为249.00 mg GAE/L、281.54 mg GAE/L和1405.92 mg GAE/L，比其加乙醛之前分别降低了32%、12%和21%。在红色果酒中，蓝莓酒、杨梅酒和火龙果酒的线性回归方程分别为y=2.1412x+1345.7、R2=0.9462，y=1.0533x+349、 R2=0.9616，y=0.6788x+370.99、R2=0.979。根据其线性回归方程计算出当其总SO2含量为200mg/L时，其总酚含量分别为 1773.94 mg GAE/L、559.66 mg GAE/L和506.75 mg GAE/L，比其加乙醛之前分别降低了23%、47%和8%。因此可以得出游离SO2对果酒的总酚含量有促进作用，由于总酚含量的增加可促进果酒抗氧化能力的增强，所以果酒的抗氧化能力也随之增强。

图3 添加乙醛的条件下测定白色果酒的总酚含量

图4 添加乙醛的条件下测定红色果酒的总酚含量

2.3 非酚类抗氧化物质在果酒中的含量

抗坏血酸存在于许多水果中，并广泛用作白葡萄酒的防腐剂，且脱氢抗坏血酸是抗坏血酸氧化产物，其本身就是一种抗氧化剂。谷胱甘肽具有解毒作用，可用于药物，也可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。非酚类抗氧化物质在这6种果酒中的含量如下页表3所示。

通过HPLC外标法测得的L-抗坏血酸和谷胱甘肽的标准曲线线性回归方程分别是y=59656x-50359、R2=0.9991和y=345008x-309288、R2=0.9996。由表3可知，这3种非酚类抗氧化物质在不同果酒中含量各不相同，其中谷胱甘肽在这6种果酒中的含量较少，抗坏血酸在果酒中的含量较多且差异比较显著。在白色果酒中，白葡萄酒的非酚类物质含量最高，而在红色果酒中，蓝莓酒的非酚类物质含量最高。

表3 不同果酒的非酚类抗氧化物质的含量

2.4 非酚类物质对果酒总抗氧化能力的影响

参考Bridi等的方法用交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP） 将样品进行3次处理，由于PVPP可吸附酚类化合物，所以通过预先除去酚类物质来实现非酚类化合物对果酒总抗氧化强度的测定。加入PVPP后样品总酚含量如图5、图6所示。

图5 添加PVPP条件下测定白色果酒中的总酚含量

图6 添加PVPP条件下测定不同果酒的总酚含量

由图5、图6可知，当除去游离SO2和酚类物质后，不管是白色果酒还是红色果酒，它们的总酚含量都明显下降。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的线性回归方程分别为y=0.0208x+3.834、R2=0.9911，y=0.0759x+21.136、R2=0.9954，y=0.3154x+118.83、R2=0.9963。根据其线性回归方程计算出当其总SO2含量为200 mg/L时，其总酚含量为7.99 mg GAE/L、36.32 mg GAE/L和181.83 mg GAE/L，比其加PVPP之前分别降低了97%、87%和87%。在红色果酒中，蓝莓酒、杨梅酒和火龙果酒的线性回归方程分别为y=0.0425x+13.64、R2=0.9837，y=0.3663x+96.432、R2=0.9908，y=0.7917x+82.078、R2=0.9945。根据其线性回归方程计算出当其总SO2含量为200 mg/L时，其总酚含量为22.14 mg GAE/L、169.69 mg GAE/L和 240.42 mg.GAE/L，比其加PVPP之前分别降低了99%、70%和53%。由此可证明当去除酚类物质后，果酒的抗氧化能力明显减弱。

2.5 酚类物质在果酒中的含量

酚类化合物是果酒的主要功能性成分，广泛存在于水果中。果酒是由这些水果酿造而成，所以果酒中的酚类化合物含量也较丰富。本研究针对6种果酒进行酚类物质的测定，结果见表4。

表4 6种果酒中酚类物质的含量

FCR方法测定没食子酸的标准曲线方程为y=7.65x+0.0093、R2=0.9985；总黄酮测定中儿茶素的标准曲线方程为y=2.4843x-0.0036，R2=0.9987。由表4可知，红色果酒中的酚类物质含量比白色果酒中的高，在白色果酒中，宣木瓜的酚类物质含量最高，水蜜桃酒次之，白葡萄酒含量最低。在红色果酒中蓝莓酒的酚类物质含量最高，杨梅酒次之，火龙果最少。

2.6 酚类物质对果酒总抗氧化能力的影响

本研究主要是区分SO2、非酚类抗氧化物质和酚类物质对果酒总体抗氧化作用大小，用FCR方法分别测定不同处理下果酒的抗氧化能力，结果见表5。

表5 FCR方法测得的果酒在不同条件下的抗氧化能力

FCR方法为果酒的抗氧化性研究提供了有效的依据。如果已知特定抗氧化剂的摩尔浓度及其吸光度，可根据其线性回归方程y=7.65x+0.0093、R2=0.9985计算出对应的总酚含量，从而计算出对总抗氧化能力的相对作用。由表5可知，在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒中SO2的抗氧化性分别占总体抗氧化性的9%、6%和8%，非酚类物质分别占总体抗氧化性的6%、10%和8%，总酚物质的抗氧化性分别占总体抗氧化性的85%、84%和84%。在红色果酒中，蓝莓酒、杨梅酒和火龙果酒中SO2的抗氧化性分别占总体抗氧化性的19%、15%和11%，主要非酚类物质分别占总体抗氧化性的31%、34%和28%，总酚物质的抗氧化性分别占总体抗氧化性的50%、51%和61%。

3 结 论

本研究使用FCR方法确定6种果酒中SO2、非酚类抗氧化物质和酚类物质对总抗氧化作用的大小。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒中SO2的抗氧化性分别占总体抗氧化性的9%、6%和8%，非酚类物质分别占总体抗氧化性的6%、10%和8%，总酚物质的抗氧化性分别占总体抗氧化性的85%、84%和84%。在红色果酒中，蓝莓酒、杨梅酒和火龙果酒中SO2的抗氧化性分别占总体抗氧化性的19%、15%和11%，主要非酚类物质分别占总体抗氧化性的31%、34%和28%，总酚物质的抗氧化性分别占总体抗氧化性的50%、51%和61%。总酚类物质对红色果酒的抗氧化能力相对较低，这是由于红色果酒中非酚类物质含量较高。

试验结果表明，无论是白色果酒还是红色果酒，酚类物质的抗氧化作用都大于SO2和非酚类抗氧化物质的作用。在白色果酒中，宣木瓜酒的抗氧化性最强，水蜜桃酒次之，白葡萄酒最弱。在红色果酒中，蓝莓酒的抗氧化性最强，杨梅酒次之，火龙果最弱。