狗枣猕猴桃锌指蛋白的生物信息学分析

陈 鑫，李然红，刘 丹，王立凤

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157012)

狗枣猕猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕，别名狗枣子，大型落叶藤本植物，主要分布于我国东北、河北、云南等地。狗枣猕猴桃是最耐寒的猕猴桃品种之一，为良好的抗寒育种资源，其在生长发育过程中叶片颜色会发生动态变化，形成白、粉、浅红和浅绿的斑状彩叶，其果实柔软多汁、酸甜可口、富含维生素C，是一种药食观赏兼用植物[1-3]。锌指蛋白(zinc finger proteins，ZFP)是指含有通过结合Zn2+可以自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质，主要由半胱氨酸和组氨酸残基与Zn2+结合成立体结构[4]。研究发现[5]，锌指蛋白参与植物的生长发育、逆境胁迫应答等功能，并广泛存在于动植物和微生物中。WU等[6-7]研究表明，ZFP可以激活水稻种子中赤霉素(GA)合成基因表达，从而打破种子休眠，提高发芽率，ZFP8通过调节细胞分裂素(CK)的信号传导，能够促进拟南芥的细胞分化，促进植株生长。ZFP能够在低温、干旱、盐碱等胁迫环境中发挥重要作用，番茄、枳、烟草、大豆中的锌指蛋白ZFP均在逆境环境中大量表达，巨桉的EgrZFP6能够参与胁迫响应的负调控，提高植物对低温的敏感性[8-10]。有关狗枣猕猴桃ZFP基因的研究国内尚未见报道。因此，笔者以狗枣猕猴桃转录组数据为参考，筛选到锌指蛋白的cDNA序列，利用生物信息学方法对其理化性质、疏水性/亲水性、蛋白结构功能域、二级结构、三级结构、蛋白质修饰位点及同源性等方面进行预测和分析，以期为狗枣猕猴桃ZFP蛋白功能研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料

狗枣猕猴桃锌指蛋白cDNA序列从牡丹江师范学院植物遗传育种课题组经试剂盒提取植物总RNA，反转录后送测序公司获得；胡桃(Juglansregia，XP_018811460.1)、葡萄(Vitisvinifera，XP_002278326.1)、罗布斯塔咖啡(Coffeacanephora，CDP13009.1)、小粒咖啡(CoffeaArabica，XP_027084413.1)、蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002519824.1)、木薯(Manihotesculenta，XP_021599867.1)、可可树(Theobromacacao，XP_017972715.1)、胡杨(Populuseuphratica，XP_011028187.1)、毛果杨(Populustrichocarpa，XP_006385648.1)、黄灯笼辣椒(Capsicumchinense，PHU28666.1)、辣椒(Capsicumannuum，XP_016554111.1)、黄麻(Corchoruscapsularis，OMP11099.1)、浆果状辣椒(Capsicumbaccatum，PHT58273.1)、土瓶草(Cephalotusfollicularis，GAV69097.1)、橙子(Citrussinensis，KDO42906.1)、橡胶树(Heveabrasiliensis，XP_021679968.1)、番木瓜(Caricapapaya，XP_021912676.1)、榴莲(Duriozibethinus，XP_022772370.1)、水芙蓉(Nelumbonucifera，XP_010269999.1)、中华猕猴桃原变种(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS11627.1)等植物氨基酸序列在NCBI数据库中下载。

1.2 方法

狗枣猕猴桃AkZFP的理化性质用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)进行分析；NCBI-CDD进行保守结构域及蛋白家族预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/ interpro/search/sequence-search)预测功能位点；NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk /services/NetNGlyc/)对N-糖基化位点进行预测；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)对O-糖基化位点进行预测；采用SOPMA及PredictProtein 数据库(https://www.predictprotein.org/)对AkZFP进行二级结构及蛋白质修饰位点预测；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在线软件预测蛋白质三级结构。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得20条不同植物的ZFP氨基酸序列信息，利用MEGA5.1软件的Neighbor-joining法构建蛋白质系统进化树。

2 结果与分析

2.1 AkZFP的理化性质

经分析表明，AkZFP基因cDNA全长为788 bp，编码区(CDS)为cDNA上第56～733个碱基，共编码226个氨基酸，分子量24 778.46 Da，理论等电点为5.61，负电荷残基总数(Asp+Glu)为21，正电荷残基总数(Arg+Lys)为13，分子式为C1082H1649N309O342S10，总原子数3 392，不稳定指数(instability index,Ⅱ)为51.78，脂肪系数(Aliphatic index)为64.03，亲水性(GRAVY)的平均水平为-0.549，说明该蛋白为亲水非稳定性蛋白。该蛋白中含量最多的为丝氨酸，占11.5%;其次为脯氨酸和亮氨酸，各占10.2%和9.3%;含量最少的为赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸，均为1.8%(图1)，吡咯赖氨酸及硒半胱氨酸含量为0。通过ProtScale软件分析预测(图2)，该基因蛋白的整个肽链中均含有亲水性和疏水性氨基酸，得分最大值为1.689,在119个氨基酸处;最小值为-3.122,在第203个氨基酸处。从整体分布看，氨基酸的负值多且分值大，根据蛋白质亲水和疏水的得分判定该蛋白为亲水蛋白。

图1 狗枣猕猴桃ZPF基因编码蛋白质的氨基酸组成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theZPFgene ofA.kolomikta

图2 AkZFP的亲水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity of AkZFP

2.2 AkZFP的信号肽及跨膜结构

经SignalP-4.1预测(图3)，AkZFP蛋白不含信号肽，同时不存在跨膜结构。

注：C值，S值和Y值分别是原始剪切位点、信号肽和综合剪切位点的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

图3 AkZFP蛋白信号肽及跨膜结构

Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkZFP

2.3 AkZFP的结构域预测

经对AkZFP保守序列及蛋白家族预测表明(图4)，AkZFP是ZFP基因家族的ZF-C2H2-6成员，其第76～100氨基酸的序列区域为ZFP6组的保守结构域。

图4 AkZFP蛋白的保守序列

Fig.4 Conservative protein sequence of AkZFP

2.4 AkZFP的二级、三级结构

经对AkZFP的二级结构进行预测(图5)，该蛋白21.68%可能会形成螺旋，12.83%可能形成延伸链，2.65%可能形成转角，62.83%为无规卷曲，无二硫键的形成和特殊的二级结构。用SWISS-MODEL对AkZFP蛋白进行三级结构预测，结果(图6)显示，AkZFP的功能结构域在第73～105个氨基酸上，同时含有QALGGH手指结构。

图5 AkZFP蛋白的二级结构预测

Fig.5 Secondary structure prediction of AkZFP protein

图6 AkZFP蛋白的三级结构预测

Fig.6 Tertiary structure prediction of AkZFP protein

2.5 AkZFP的蛋白质修饰位点

经预测，该蛋白内有5个潜在的N-糖基化位点，分别在15(NISH)、30(NPSY)、162(NKSL)、183(NSSL)及203(NHTN)氨基酸处。NetOGlyc4.0 server对O-糖基化位点进行预测，预测分数均大于0.5的认为是阳性，故推测该蛋白内含23个O-糖基化位点。AkZFP含有4个糖基化位点(N-glycosylation site)分别在第15个、162个、183个、203个氨基酸处，1个酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylation site)在190个氨基酸处，1个十四烷酰化位点(N-myristoylation site)在92个氨基酸处，1个锌指C2H2型结构域(Zinc finger C2H2 type domain signature)序列在78个氨基酸处。

2.6 AkZFP的氨基酸序列同源性

狗枣猕猴桃AkZFP氨基酸序列经与NCBI数据库中的20种植物氨基酸进行同源性比对表明，狗枣猕猴桃AkZFP与中华猕猴桃原变种亲缘关系较近，而与罗布斯塔咖啡、蓖麻等植物亲缘关系较远(图7)。

图7 ZFP的系统进化树

Fig.7 System phylogenetic tree of ZFP

3 讨论

锌指蛋白直接或间接参与植物的生长发育、根系建成、逆境响应及信号调节等生理生化过程。目前已经从多种植物中克隆到ZFP基因包括拟南芥、大豆、小麦、水稻、矮牵牛等[11]。根据半胱氨酸和组氨酸残基的数目和位置分为C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC、C3H等多种类型，在植物中具有高度保守基因序列QALGGH。试验利用已测的狗枣猕猴桃转录组数据，筛选出狗枣猕猴桃ZFP基因cDNA序列信息，并对其进行了生物信息学分析。结果表明：ZFP基因cDNA全长为788 bp，编码区(CDS)为cDNA上第56～733个碱基，共编码226个氨基酸，是ZFP-6(PFAM13912)家族的一员，C2H2型，包含1个QALGGH保守序列，属于亲水性、非稳定的蛋白，蛋白中丝氨酸、脯氨酸和亮氨酸含量较高，没有跨膜结构。AkZFP在NCBI数据库中进行BLAST，显示与狗枣猕猴桃ZFP相比序列中，一致性最高的为90.32%，最低的为44.18%。选取20种植物的氨基酸序列与AkZFP进行比对得出，AkZFP与中华猕猴桃原变种亲缘关系较近，而与罗布斯塔咖啡、蓖麻等植物亲缘关系较远。为进一步研究狗枣猕猴桃锌指蛋白基因功能提供了一定的理论基础。