GnRH激动剂在子宫腺肌病治疗中自噬现象与作用机制研究

张迪

子宫腺肌病是生育期女性的常见疾病，主要临床表现为痛经、月经量增多及性交痛，同时，腺肌病也是导致女性不孕的常见原因之一。GnRH-a是治疗子宫腺肌病的常用药物，通过与GnRH-a受体结合，引起一系列生物学效应，首先引起促性腺激素的释放增加，此效应为“flare-up effect”，大约持续10 d左右，后来由于促性腺激素的耗竭，促性腺激素释放减少，进而导致卵巢分泌激素的减少，此效应为“pituitary down-regulation”[1]。因腺肌病为雌激素依赖性疾病，雌激素的减少导致病灶萎缩，这被认为是GnRH-a的作用机制。近年，有体外实验发现，GnRH-a可以抑制腺肌病在位内膜的增殖，这提示在腺肌病治疗中，GnRH-a除垂体降调节作用，可能还存在其他方面的作用机制。

自噬(autophagy)，由Ashford和Porter于1962年首次发现[2]，他们观察到细胞内有“自己吃自己”的现象，然后提出自噬的定义，即从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分细胞质以及细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，借此实现细胞器的更新和细胞本身的代谢需求。自噬在炎症、肿瘤、心血管疾病、免疫调节、神经退行性疾病中发挥重要作用。目前，国内外研究的三大类自噬相关疾病分别是肿瘤、神经退行性疾病和免疫性疾病[3-5]。本研究选择与细胞周期密切相关的自噬为切入点，研究GnRH-a与小鼠子宫内膜细胞自噬的相关性。

材料与方法

一、实验动物

ICR孕鼠5只(上海斯莱克实验动物有限责任公司，上海，中国)，鼠龄7～8周，平均体重(40.0±0.5)g，均体健，在整个孕期，孕鼠均独笼饲养，出生的雌性小鼠用于后续研究，小鼠均饲养于温度可控的小鼠笼具中，房间光照/黑暗维持在12 h白天/12 h黑夜的周期。小鼠可以自由摄取食物和水。

二、方法

1.腺肌病小鼠模型的建立：根据不同干预措施将小鼠分为3组，分别是正常对照组(生理盐水+生理盐水)、腺肌病模型组(他莫昔芬+生理盐水)、腺肌病GnRH-a治疗组(他莫昔芬+GnRH-a)。子宫腺肌病模型鼠采用文献报道的建模方法[6-7]，即新生小鼠饲养枸橼酸他莫昔芬的方法。随机选取16只雌性新生小鼠造模，鼠龄2～5 d，平均体重(2.0±0.1)g，均体健；另外8只作为正常对照组。建模小鼠于出生后第2～5 d(出生日为第1日)，滴喂5 ml/g的花生油/卵磷脂/炼乳混合液(体积比2：0.2：3)，并按体重加入2.7 μmol/kg的枸橼酸他莫昔芬。正常对照组用生理盐水代替枸橼酸他莫昔芬，其他处置方法均与模型组小鼠相同。

饲养光照∶黑暗周期为12 h∶12 h, 室温控制在(24.0±0.5)℃,小鼠可以自由获取水，1～21 d龄由母鼠哺乳喂养，22 d起幼鼠与母鼠分笼饲养，幼鼠可自由摄食饮水。

于鼠龄75 d，按照随机原则将16只子宫腺肌病模型鼠分为腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组，每组各8只。腺肌病GnRH-a治疗组：给予单次长效GnRH-a 8 mg腹腔内注射(辉凌制药有限公司，基尔，德国)[8]；腺肌病模型组给予相同数量的生理盐水，不含GnRH-a，其他处置方法与GnRH-a治疗组相同。4周后，每日19:00～次日07:00与正常性成熟雄性小鼠以1∶1的比例合笼，次日8:00检查雌鼠是否出现阴道栓，见阴栓日记为妊娠第1日，依次类推。雄性小鼠仅交配1次，且均有生育史。

2.标本采集与保存：小鼠于妊娠第4日19:00～20:00处死，然后立即取子宫，所得子宫标本，使用0.9%生理盐水反复冲洗，称重后数码相机拍照，然后将子宫分为3份，1份进行HE染色，然后随机选择3个视野进行子宫病理变化检测，如果确认造模成功，该标本可以用于后续的实验，将该子宫标本的另一半采用“挤压法”获取子宫内膜组织，于液氮内速冻，然后置于-80 ℃冰箱冻存，供后续提取蛋白进行自噬相关蛋白检测。剩余的第3份子宫标本用于透射电镜检测。

3.组织形态学观察：经4%多聚甲醛固定的子宫标本常规石蜡包埋，然后连续切片，厚度为4 μm，60 ℃烤片3 h，逐级脱蜡，脱水，行苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察子宫内膜层是否完整、内膜或腺体组织是否浸润肌层内，使用数码相机拍照。HE染色步骤包括(1)二甲苯15 min，二甲苯15 min，无水乙醇5 min，无水乙醇5 min，95%乙醇5 min，75%乙醇5 min，50%乙醇5 min，蒸馏水5 min；(2)苏木精染色5 min，洗掉多余染液；(3)1%盐酸酒精分化3～5 s；(4)迅速置于自来水中，流水冲洗30 min；(5)0.5%～1%伊红染液(45 s～1 min可根据染色结果和要求调整染色时间)；(6)95%乙醇Ⅰ(2 s～1 min)，95%乙醇Ⅱ(2 s或迅速)；(7)无水乙醇Ⅰ(1 min)，无水乙醇Ⅱ(1 min)；(8)二甲苯Ⅰ(5 min)，二甲苯Ⅱ(5 min)；(9)中性树胶封片，自然风干，置于显微镜下观察。

4.自噬相关蛋白表达：相关蛋白包括自噬相关蛋白(LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，Beclin-1)。取子宫内膜组织，置于冰盒上低温操作，加入细胞裂解液，4 ℃下组织匀浆，4 ℃静置10 min，4 ℃下12 000 r/min离心30 min，小心吸取上清液，-80 ℃冻存用时取出。用牛血清白蛋白作为标准品，定量蛋白浓度，取等量的总蛋白约50 ug加入适量6×l aemelli buffer，用NETEN裂解液调整样本体积保持上样量的液体总体积相同。煮沸5 min蛋白变性，置于冰上迅速冷却离心一下。上样动作要轻，防止上样本溢出。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加一抗于4 ℃孵育过夜。加二抗室温孵育2 h，TBST洗膜后，ECL浇膜，暗室中曝光，显影，扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析。

5.自噬小体的观察：(1)取子宫全层组织，大小1 mm×2 mm；(2)前固定。2%戊二醛PBS固定液固定2 h，4 ℃；(3)漂洗。PBS缓冲液洗涤2次，每次10 min，4 ℃；(4)后固定。1%锇酸PBS固定液固定2 h，4 ℃；(5)漂洗。PBS缓冲液洗涤2次每次10 min，4 ℃；(6)脱水。30%→50%→70%乙醇逐级脱水，每次10 min，(70%乙醇含3%醋酸双氧铀)4 ℃，块染，80%→95%→100%→100%乙醇逐级脱水，每次10 min；(7)置换。环氧丙烷，2次，每次10 min；(8)浸透。环氧树脂618包埋液与环氧丙烷1∶12 h，环氧树脂618包埋液与环氧丙烷2∶1，过夜，纯环氧树脂618包埋液浸透，37 ℃，6 h；(9)包埋。60 ℃烘箱内48 h；(10)切片。LKB V型超薄切片机切片；(11)染色。枸橼酸铅电子染色；(12)观察。PHILIP(荷兰菲利浦公司)CM-120透射电镜观察。

6.统计学处理：采用SPSS17.0统计软件，组间表达水平的比较采用非对称t检验，结果数据采用均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、子宫腺肌病模型的建立

在整个建模过程中，仅有1只小鼠模型未成功，GnRH-a治疗组有两只小鼠死亡，提示该方法是一种有效建模方法。腺肌病建模是否成功依靠病理学检测，本实验采用HE染色法，结果如图1，腺肌病模型组见子宫内膜腺体异位于子宫肌层中，同时看到肌层细胞排列紊乱，伴增生、肥大(A、B)；腺肌病GnRH-a治疗组，表现同腺肌病模型组，可见异位腺体萎缩(C、D)。

二、腺肌病GnRH-a治疗作用与自噬相关性研究

1.子宫形态：通过正常对照组、腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组子宫称重比较，正常对照组与腺肌病模型组的小鼠子宫重量相比，差异未见统计学意义；而腺肌病模型组经GnRH-a治疗后小鼠子宫的重量与治疗前相比，差异有统计学意义。见图2、图3。

2.自噬小体的数量：通过透射电镜观察显示，正常对照组子宫内膜间质细胞内可见典型、数量较多的自噬小体，而在腺肌病模型组子宫内膜间质细胞内未见到典型的自噬小体，而经GnRH-a治疗后，在腺肌病模型组子宫内膜间质细胞内又见到典型的自噬小体，见图4、图5。

3.自噬相关蛋白(Beclin-1、LC-3)表达水平：3组自噬相关蛋白比较显示，腺肌病模型组Beclin-1蛋白质表达量较正常对照组显著减少，而腺肌病模型组接受GnRH-a治疗后Beclin-1蛋白质表达量显著增加。LC-3Ⅱ蛋白质表达水平结果同Beclin-1蛋白表达相似，即腺肌病模型组LC-3Ⅱ蛋白质表达量较正常对照组显著减少，而腺肌病模型组接受GnRH-a治疗后LC-3Ⅱ蛋白质表达量显著增加。见图6、图7。

讨 论

本研究中采用的ICR小鼠具有体格健壮，繁殖力强，生长速度快，适应性强、实验重复性较好等优点。正常对照组小鼠病理组织学显示平滑肌层纤维向心性规则地环绕在内膜外，未见腺肌病病理改变的发生。而在腺肌病模型组，新生ICR小鼠给予滴喂他莫西芬，在100日龄左右时病理组织学检查显示内膜腺体和间质异位于肌层，同时伴有肌层平滑肌明显的结构紊乱，形成间质浸润。研究中仅有1例建模未成功，这和国内外文献报道相似，即新生鼠喂养他莫昔芬可以诱导成年后子宫腺肌病的发生[7]。枸橼酸他莫西芬具有抗雌激素的作用，其机制尚不明确，可能与其导致子宫肌层分化紊乱、组织结构重塑有关[6]。2009年，李雁等[7]用阴道脱落细胞法监测小鼠动情周期的改变，结果显示大部分105～110 d模型鼠动情周期恢复正常，只有很少部分出现连续多日处于动情期，从而排除枸橼酸他莫昔芬本身对卵巢功能的影响。

Adenomyosis group (A、B); GnRH agonist treatment group (C、D). The arrow points to the area of the ectopic lesions图1 腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组经 HE染色后光镜结果(A、C：×40，B、D：×100)Figure 1 Light microscopy results of adenomyosis model group and GnRH agonist treatment group after HE staining(A、C：× 40，B、D：× 100)

图2 正常对照组、腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组子宫大体标本Figure 2 Uterus specimens of control group, adenomyosis model group and GnRH agonist treatment group

图3 正常对照组、腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组子宫重量比较Figure 3 The uteruses weight of control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group

图4 正常对照组、腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组三组透射电镜下所见(箭头所指为典型的自噬小体，×4000)Figure 4Transmission electron microscope images of endometrial cells among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group (Arrows indicate representative autophagosomes, ×4000)

图5 正常对照组、腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组三组自噬小体定量比较(*P<0.05)Figure 5 The number of autophagosomes among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group (*P<0.05)

图6 自噬相关蛋白Beclin-1在正常对照组、腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组三组的表达情况Figure 6 The expression of autophagy-related proteins Beclin 1 among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group

图7 自噬相关蛋白LC-3在正常对照组、腺肌病模型组、腺肌病GnRH-a治疗组三组的表达情况Figure 7 The expression of autophagy-related proteins LC-3 among control group, adenomyosis group and GnRH agonist treatment group

自噬是真核细胞蛋白质降解的重要途径，可分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬三大类，此分类方法是根据细胞内部物质转运至溶酶体内途径的不同而分的，本实验主要研究第一大类，即大自噬，以下均简称自噬。自1950年左右，透射电镜开始用于自噬的研究，目前被广泛用于自噬形态学研究中[9]。在本研究实验中，发现子宫腺肌病在位内膜的自噬水平较正常对照组在位内膜的自噬水平显著降低，这主要表现为透射电镜下自噬小体数量显著减少。由于在透射电镜下有时很难区别自噬小体和细胞内囊泡状结构，为了克服该不足，本实验同时研究了自噬相关蛋白，即Becilin-1和LC-3的表达水平。在腺肌病模型组，两种蛋白的表达水平也显著低于正常对照组，和本实验透射电镜的观察结果相同。众所周知，子宫腺肌病虽然被认为是子宫良性疾病，但它却具有类似于恶性肿瘤的生物学行为，如内膜细胞增殖破坏细胞外的基质，破坏、突破基底板，进而迁徙进入子宫肌层种植生长并不断进一步迁移，这种类似于恶性肿瘤的生物学行为也是子宫腺肌病主要的发病机制之一。2003年，Qu等[10]通过一项肿瘤小鼠模型体外实验研究发现，Beclin-1等位基因的缺失可以导致自噬水平显著降低，进而细胞增殖速度加快。此外，2007年，Takahashi等[11]通过体外实验研究发现，Bif-1与自噬相关基因Beclin-1结合，进而激活自噬或者是激活肿瘤抑制因子，从而发挥抗肿瘤的作用。本研究结果显示，子宫腺肌病在位内膜Beclin-1蛋白表达水平显著低于正常对照组的表达水平，提示腺肌病自噬水平异常降低，进而使细胞增殖速度加快，Beclin-1蛋白表达的减低可能利于子宫内膜腺体和间质增殖并侵袭进入子宫肌层进而在子宫肌层中迁移、生长，可见Beclin-1在子宫腺肌病的发生、发展中发挥着重要作用。另外有研究显示[12]，子宫腺肌病在位内膜与正常生育期女性的在位内膜相比，存在免疫机制的异常，包括细胞表面抗原、粘附分子、巨噬细胞及免疫细胞及免疫复合物的数量及成分，同时在腺肌病患者外周血中也发现存在异常的自身抗体。Paludan等[13]曾报道，自噬有助于MHC2复合物对体内长期存在抗原的监视作用，从而在抗原提呈过程中发挥重要作用，提示子宫腺肌病患者的自噬水平被抑制后，可能有利于异位子宫内膜细胞逃脱免疫监视，进而有利于在子宫肌层种植播散，最终导致了子宫腺肌病的发生。2008年，Wang等[14]通过研究34例子宫腺肌病患者及11例子宫肌瘤患者在位及异位内膜组织发现，腺肌病患者在位内膜和异位内膜白细胞抗原-G表达水平均异常增高，从而逃避免疫监视及免疫清除，可见自噬和免疫调节之间也存在密切的关系。

在本项研究，即子宫腺肌病中GnRH-a与自噬相关性研究中，子宫腺肌病模型组小鼠经GnRH-a治疗后，在位子宫内膜自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3的表达水平均显著升高，此外，在透射电镜下本研究观察到自噬小体的数量较未治疗组也明显增加。Choi等[15]研究发现，在子宫内膜异位症的异位内膜细胞，甾体激素药物(达那唑)可以抑制Akt和ERK1/2的活性，进而抑制mTOR，最终诱导自噬的发生，由于GnRH-a同达那唑类似，均具有抗促性腺激素作用，提示GnRH-a可能通过类似的机制，即Akt-ERK1/2-mTOR途径发挥作用，这需要后续的深入研究。

此外，本研究也提示GnRH-a的作用原理除了产生“低雌激素”的作用机制外，尚有部分是以自分泌或旁分泌机制通过与其局部受体结合，介导直接抑制子宫在位内膜细胞增殖，诱导其自噬，提高其自噬水平，减少其向远处发展的可能，从而达到治疗效果。

本研究显示子宫腺肌病小鼠在位内膜自噬水平低于正常对照组，说明自噬水平的减低，在子宫腺肌病的发生和发展中发挥一定作用，它可能发展成为治疗子宫腺肌病新的靶点；而经GnRH-a治疗后，在位子宫内膜的自噬水平显著提高，提示GnRH-a可通过纠正异常的自噬水平发挥治疗作用，对GnRH-a的作用机制有了更加深入的认识。在临床工作中可考虑将自噬、凋亡诱导/抑制药物与降调方案配合使用，以期增强GnRH-a降调方案对腺肌病不孕症患者的治疗效果。

(图4见封三)