解脲支原体生物亚群及抗子宫内膜抗体与女性不孕的相关性研究

曾文军　王柳均　梅艳娟　邓珍良　皮红泉　陈群

【摘要】 目的：探讨解脲支原体（UU）不同生物亚群、抗子宫内膜抗体（AEMAb）与女性不孕患者的关系。方法：选取本院2017年2月-2018年2月100例不孕女性为不孕组，同期选取100例健康孕妇为对照组，两组均行UU培养，通过聚合酶链反应并以多条带抗原基因为靶位设计引物将检测到的UU进行分群，应用ELISA方法检测AEMAb，同时进行相关分析。结果：不孕组UU及其UU2生物亚群与AEMAb阳性率均明显高于对照组（P<0.01），不孕组以UU2生物亚群为主，对照组以UU1生物亚群为主，而两组UU1生物亚群比较差异无统计学意义（P>0.05）。不孕组AEMAb阳性者UU及UU2生物亚群感染率明显高于AEMAb阴性者（P<0.01），两者UU1生物亚群比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：女性不孕的发生与UU及AEMAb有关，UU1生物亚群可能是定植菌群，而UU2生物亚群则更易导致机体产生AEMAb引起不育。

【关键词】 解脲支原体; 生物亚群; 抗子宫内膜抗体; 聚合酶链反应; 不孕

【Abstract】 Objective：To study the association between biovars of ureaplasma urealyticum （UU） and antiendometrium antibody（AEMAb） in infertile women.Method：100 infertile women in our hospital from February 2017 to February 2018 were selected as infertile group，at the same time 100 healthy pregnant women were selected as control group，they were given UU cultured.The detected UU was grouped by polymerase chain reaction and primers were designed with multiple antigen genes as targets.AEMAb was detected by ELISA，and the correlation analysis was carried out.Result：There were significant differences in positive rate of UU，UU2 and AEMAb between infertility group and control group（P<0.01）.Biovar UU1 was the main biovar in control group and infertility group were mainly infected with biovar UU2.No significant difference was found in biovar UU1 between two groups（P>0.05）.The positive rate of AEMAb in positive UU and biovar UU2 were significantly higher than that of negative rate of AEMAb（P<0.01），but biovar UU1 was no significant difference in infertility group（P>0.05）.Conclusion：It is suggested that infertile women is closely correlated with UU and AEMAb;UU1 is the colonized biovar，UU2 may be cause infertility easily because of inducing AEMAb.

【Key words】 Ureaplasma urealyticum; Biovars subgroup; Antiendometrium antibody; Polymerase chain reaction; Infertility

First-authors address：Dongguan Changping Hospital Affiliated of Jinan Universty，Dongguan 523573，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.035

解脲支原体（UU）是女性宫颈寄居最常见的微生物之一，具有一定的致病性，按照不同的生物表型及基因特征分为UU1（即Parvo生物群，包括1、3、6、14四种血清型）与UU2（即T960生物群，包括2、4、5、7-13十种血清型）两种生物亚群，而且不同的生物亚群可能与宫颈盆腔炎症、不孕不育、早产流产、新生儿肺炎有关[1]。抗子宫内膜抗体（AEMAb）是以子宫内膜为靶抗原并引起一系列免疫反应的自身抗体，与免疫性不孕关系密切，它的产生有诸多学说，但生殖道微生物感染是诱因之一[2]。本研究采用分子生物学检测UU不同生物亚群及AEMAb与女性不孕关系，旨在为临床诊治及优生优育提供一定依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2017年2月-2018年2月符合女性不孕标准（未采取避孕措施正常同居2年以上而未妊娠）患者100例为不孕组，年龄22～40岁，平均（29.1±4.2）岁。（1）纳入标准：①无器质性病变;②夫妻生活正常;③月经正常;④配偶精液正常。（2）排除标准：①其他细菌及病毒感染;②遗传性疾病、先天不育不孕及排卵障碍;③外伤及手术史、严重内科疾患、癌症病史;④配偶精液异常。选取本院同时期具有可比性的100例健康孕妇为对照组，年龄23～41岁，平均（28.9±3.9）岁（P>0.05）。參与者均知晓同意并签署知情同意书，且该研究通过本院医学伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂及仪器 SU-CF-IF型净化工作台，PCR仪，电热恒温水箱，Clinibio 128C酶标仪，国产洗板机，紫外线灯，UU液体及固体培养基，UU3（UU1生物亚群）及UU8（UU2生物亚群）标准菌株。PCR反应试剂盒及DNA marker，DNA引物，琼脂糖，AEMAb试剂。

1.3 AEMAb检测 采用ELISA法检测，空腹抽取静脉血3 mL分离血清-20 ℃保存备用。测定时血清作1︰100稀释，加稀释血清100 μL至包被孔内，并作阴阳性对照各一孔，经温浴、洗涤、显色等步骤，最后加终止液终止显色，450 nm波长酶标仪测定各孔光密度（OD）值。P/N≥2.1者为阳性（P：待测血清OD值，N：阴性对照OD值。当N<0.1时，则以0.1计）。

1.4 UU检测培养及生物群鉴定 （1）UU检测培养：收集宫颈拭子标本，经分离、纯化、鉴定、培养增殖后置-20 ℃医用冰箱备用。（2）菌株DNA提取：自医用冰箱中取出临床标本与标准菌株，解冻后吸取500 μL液体，10 000 r/min离心15 min，吸取上清液;加入100 μL的蛋白酶K溶液;55 ℃水浴1 h;95 ℃保温灭活蛋白酶K 10 min;10 000 r/min 离心1 min，取上清液作PCR。（3）PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳：以多条带抗原基因为靶位设计分群引物进行鉴定，并设空白对照。UU分群引物上游为5-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3;下游为5-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTC-3。UU1及UU2生物亚群扩增产物分别为403 bp、448 bp。PCR反应体系为20 μM引物各2 μL，3 U/μL Taq酶1 μL，10×PCR Buffer （含Mg2+）5 μL，3 mM dNTP，混合物5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 40 μL，总反应体积100 μL。PCR反应设为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40个循环，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定[3]。

1.5 统计学处理 使用SPSS 18.0统计软件处理，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用率（%）表示，组间比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组UU及其生物亚群与AEMAb检测对比 不

孕组AEMAb检测率30.00%，健康对照1.00%，两组比较差异有统计学意义（字2=4.62，P<0.01）。不孕组UU及UU2生物亚群明显高于对照组（字2=14.74、25.25，P<0.01），不孕组以UU2为主，对照组以UU1为主，而UU1两组比较差异无统计学意义（字2=0.18，P>0.05）。见表1。本研究未发现两生物亚群混合感染的标本。

2.2 不孕组患者UU及其生物亚群与AEMAb的关系 AEMAb在UU1生物亚群比较差异无统计学意义（字2=0.005，P>0.05），而AEMAb阳性者的UU及UU2生物亚群感染率均显著增高（字2=9.79，P<0.01;字2=30.47，P<0.01）。见表2。

3 讨论

影响生殖健康的病因繁多，表现复杂，其中微生物感染与免疫不孕是重要因素之一。近年来，UU检出率不断上升，作为一种条件致病菌，当机体内环境改变或免疫变化时，定植于宿主黏膜表面会释放出NH3、各种磷脂酶、蛋白水解酶、过氧化物等毒性代谢产物导致机体损伤和炎症反应[4]。本研究不孕组UU阳性率43%，对照组18%，两者差异有显著性，说明不孕与UU一定相关，和以往研究类似[4-5]。女性感染UU不仅引起炎症损伤，输卵管纤毛运动减弱甚至堵塞，还会吸附于精子表面，降低精子质量使畸形率增高，导致精子对卵子的穿透能力下降，此外UU与精子有相似抗原导致机体产生抗精子抗体，从而引致不孕发生率增高[4-5]，故有学者建议育龄妇女不孕症要进行UU筛查及治疗。

正常情况下，育龄女性周期性剥脱子宫内膜随着月经排出体外，具有一定的免疫耐受性而不会诱导机体产生自身免疫性抗体。AEMAb是一种专门针对子宫内膜的自身特异性抗体，抗原抗体结合后激活补体，导致子宫内膜免疫病理损伤而发育不良，是影响女性不孕的重要原因之一。本研究不孕组AEMAb检测率30.00%，健康对照1.00%，两组比较差异有统计学意义（P<0.01），说明AEMAb在不孕中起重要作用。AEMAb产生后可抑制排卵、阻碍精卵结合与运送、干扰胚胎着床及影响早期胚胎的发育，导致不孕不育及早产流产的发生。AEMAb的产生除与子宫内膜异位症、子宫内膜炎有关外，而且与流产后内膜损伤及泌尿生殖道炎症关系密切。本研究中，女性不孕患者AEMAb阳性者的UU感染率明显高于AEMAb阴性者，以往研究亦提示女性不孕患者AEMAb、抗精子抗体、抗透明带抗体的产生与UU的感染有显著关系，可以诱发女性的免疫性不孕，其可能机制为微生物感染后大量炎症细胞聚集并吞噬受损子宫内膜，触发抗原提呈反应[6-7]。李会平等[2]研究证明，积极治疗UU生殖道感染有助阻止抗体形成，抗精子抗体及抗子宫内膜抗体转阴率升高，使受孕机会增高。

虽然大多数研究结果认为UU与不孕不育存在一定关系，但是也有研究证明不孕组与对照组支原体感染患病率并无差异，没必要把UU作为不孕患者的常规筛查[8]。UU在性成熟女性宫颈分离率较高，即使经过治疗转阴，经过一段时间的正常性行为又会转阳[9]，临床急需进一步研究如何判断UU是感染还是携带状态。作为条件致病微生物，UU致病影响因素主要有三方面：與生物亚群、血清型相关;与致病因子、UU浓度及感染时间相关;与宿主状态有关[1]。

UU包括2个生物亚群，它的致病性与生物亚群密切相关，多数研究倾向于UU2有一定的致病力，更容易导致宫颈盆腔炎、不孕不育及早产流产，而UU1可能是优势定植菌群而无明显致病性[1，9]。梁旭东等[11]研究发现，UU2在异位妊娠中检出率显著高于对照组，组织形态学表现为更易导致输卵管纤毛粘附、倒伏、减少甚至脱落的病变。辛亚维等[12]研究结果发现，不孕患者中UU2生物亚群检出比率高于正常女性，而UU1检出率组间比较差异无统计学意义（P>0.05），这可能与UU2促单核细胞分泌巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的能力高于UU1，MIF的增加使机体产生炎症和组织损伤。钱迎芬[13]研究亦发现，UU2具有毒性作用，UU1不具备毒性作用，引发炎症是两个亚群比例失调所致。本研究发现不孕组以UU2为主，对照组UU1为主，而UU1两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;不孕组UU2感染致AEMAb阳性者更高（P<0.01），但UU1差异无统计学意义（P>0.05），所以UU2更易导致不孕，更容易诱发机体产生免疫抗体，支持上述观点。Kwak等[14]研究发现，性工作者UU2所占比例为正常女性的5倍，更容易出现生殖系统炎症，而在正常女性UU2所占比例较小而不会出现病理特征，可能原因之一为UU2的致病因子或致病岛对宿主破坏性更大，致病性更强。笔者早期研究也发现，男女不孕不育患者UU2与抗精子抗体关系更密切[15-16]，更容易导致不孕不育，因此临床分群对诊疗甚为必要。治疗方面，多西环素对UU两大生物群敏感性均较高，UU2较UU1有更高的耐药性[17]。然而学术界亦有不同声音，有研究表明UU不同生物亚群、血清型与致病性并不存在特殊的相关性及区别，这可能与样本、取材部位、地域、实验方法、人群、种族差异有关，UU生物群致病性的多因素性和复杂性值得今后进一步探讨研究[18-20]。

综上所述，UU1生物亚群可能是定植优势菌群，而UU2生物亚群则更易导致机体产生AEMAb引起不育。临床开展UU分型分群，不但可以有的放矢进行临床诊治，而且对保障生殖健康具有重要意义。

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（收稿日期：2018-05-18） （本文編辑：周亚杰）