超声辅助提取金耳香豆素的工艺优化

牛四坤

（山西药科职业学院药学系，山西太原030031）

金耳，学名金木耳（Tremella aurantialba），属于担子菌纲银耳属，是一种珍贵的药用和食用菌类。野生金耳非常稀有，金耳种植会受到季节、场地的影响，且金耳种植产品质量不够稳定，所以目前金耳的液体发酵成为一种有前景的金耳菌生产方式，菌丝体液体发酵不受季节限制，节约场地，金耳菌丝体质量稳定性好，生产效率高，其菌丝体营养成分与子实体基本相同[1]。近年来，药理学研究表明，金耳具有抗上呼吸道感染、抗冠状动脉粥样硬化性心脏病、消炎解毒、抗凝血抗血栓的作用[2-3]。前期研究表明，金耳抗凝血的活性成分主要为香豆素类化合物，并以香豆素含量为评价指标对其提取工艺进行了研究，但该工艺能耗高、时间长、操作繁琐、香豆素类成分易被破坏。

本研究基于超声波提取技术具有快速简便、价廉、高效、不易破坏天然活性成分等优点[4-5]，以超声辅助提取法对金耳香豆素提取工艺进行了优化研究，以期为今后金耳菌丝体作为保健食品或药品提供成分分析研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器及试剂

1.1.1 材料 供试金耳菌丝体由山西省生物研究所金耳9800 菌种发酵制得，批号（20170511）。

1.1.2 试剂及仪器 补骨脂素标准品（由中国药品生物制品检定所提供）；甲醇（北京北化精细化学品有限责任公司）；无水乙醇（AR）。旋转蒸发仪RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）；紫外-可见分光光度计（SHIMADZU UV-1601PC）；超声波清洗器KS-120D（宁波海曙科声超声设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 金耳菌丝体总香豆素提取工艺[6]金耳菌丝体（湿）→清洗→烘干→粉碎→称取适量金耳菌丝体（干）→超声波醇提取→减压过滤→去除滤渣→取滤液。

1.2.2 金耳香豆素测定[7-8]

1.2.2.1 对照品溶液制备 精密称取补骨脂素标准品6.3 mg 于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，再精密吸取1 mL 至容量瓶中，甲醇定容至50 mL，制得对照品溶液。

1.2.2.2 标准曲线的绘制[9]分别精密量取补骨脂素对照品溶液1，3，5，7，10 mL 置各容量瓶中，用甲醇定容至10 mL。以甲醇为空白对照，在245 nm 处测定吸光度（A）。以吸光度（A）为纵坐标、补骨脂素浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为A＝0.007 6＋0.112 1C（r＝0.999 7，n＝5）。试验表明，补骨脂素对照品浓度在0.504 0～5.040 0 μg/mL 范围内与吸光度成线性关系。

1.2.2.3 样品香豆素测定 精密量取超声辅助提取液1 mL 置于100 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，测定吸光度，根据标准曲线计算金耳总香豆素浓度及提取率。

1.2.2.4 金耳总香豆素提取率计算 总香豆素提取率＝样品提取液浓度×体积×稀释倍数/原料质量×100%。

1.2.3 金耳菌丝体香豆素提取工艺的优化 选取液料比、超声功率、超声时间、乙醇浓度4 个因素进行单因素试验，根据4 个因素的最优试验范围，以总香豆素提取率作为优化指标，采用正交试验对金耳香豆素提取工艺进行优化。

1.3 数据处理[10]

试验数据采用Excel 2016 和SPSS 22 软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对金耳香豆素提取率的影响[11]准确称取金耳菌丝体干粉5 g，分别用30%，40%，50%，60%，70%和80%的乙醇对金耳菌丝体香豆素进行超声提取，考察乙醇浓度对提取率的影响情况。从图1 可以看出，随乙醇浓度的增加，金耳香豆素提取率先上升后下降，当乙醇浓度为50%时，金耳香豆素提取率达0.76%，为最高，这是由于50%乙醇的极性与金耳香豆素极性相近，因此，根据相似相溶原理，50%的乙醇对金耳香豆素的提取效果较好。

2.1.2 液料比对金耳香豆素提取率的影响[12]准确称取金耳菌丝体干粉5 g，分别用5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1 和30∶1（mL/g）的液料比对金耳香豆素进行提取，观察金耳香豆素的提取率。由图2 可知，在液料比为5∶1～20∶1（mL/g）范围内，随着乙醇用量的增大，金耳香豆素提取率也逐渐升高，当液料比大于20∶1时，提取率变化不大，这是因为当提取溶剂用量大到一定程度后，会增加超声波破碎细胞的阻力，一定程度上降低了金耳香豆素的提取率[11]，此时渗透压的改变不足以提高香豆素的提取率，同时考虑到成本及试剂回收的难度，选取20∶1为最佳液料比，此时金耳香豆素提取率最大，为0.74%。

2.1.3 超声波功率对金耳香豆素提取率的影响[13]准确称取金耳菌丝体干粉5 g，分别采取100，150，200，250，300，350 W 的超声波功率对金耳香豆素进行提取，考察超声功率对金耳香豆素提取率的影响。从图3 可以看出，超声功率为100～200 W 时，随着功率的增大，金耳香豆素的提取率也增加；当超声功率在200～350 W 时，金耳香豆素提取率随着超声功率的增大而逐渐降低。另外，考虑到随着超声功率的增大，金耳菌丝体细胞内物质溶出增多，增加了后期提取液中香豆素类化合物的纯化难度，确定较适宜的超声功率为200 W，此时金耳香豆素提取率为0.71%，提取率较高。

2.1.4 超声波提取时间对金耳香豆素提取率的影响[14]准确称取金耳菌丝体干粉5 g，分别采用20，30，40，50，60，70 min 的超声波提取时间对金耳菌丝体进行处理，以考察超声波提取时间与香豆素提取率的关系。从图4 可以看出，金耳香豆素提取率随着提取时间的延长在不断提高，随着提取液中香豆素含量的增加，再加上金耳菌丝体中香豆素的量逐渐减少，从而使得提取液中金耳香豆素含量增长减缓。当提取时间超过50 min 后，金耳香豆素提取率变化不大，为0.70%。考虑到时间成本及香豆素类化合物的破坏因素，提取时间50 min 较为适宜。

2.2 金耳香豆素提取工艺的优化[15-16]

在单因素试验的基础上，分别选取液料比15∶1，20∶1，25∶1（mL/g），超声波功率150，200，250 W，乙醇浓度40%，50%和60%，超声波提取时间40，50，60 min，利用正交试验对金耳香豆素的超声醇提取工艺进行优化。正交试验因素水平设计列于表1，正交试验结果列于表2。

表1 因素水平

表2 正交试验直观分析结果

表3 方差分析结果

从表2 可以看出，提取金耳香豆素的各因素主次顺序为A＞B＞D＞C，即乙醇浓度＞液料比＞超声功率＞超声时间。金耳香豆素的提取工艺条件最优组合为A2B3C1D2，即乙醇浓度为50%，液料比为25∶1，超声波提取时间为40 min，超声波功率为200 W，在此条件下，金耳香豆素的提取率达到0.85%。将试验结果进行方差分析，其结果列于表3。从表3 可以看出，乙醇浓度对金耳香豆素提取率影响显著，其他3 个因素液料比、超声时间、超声功率对金耳香豆素提取率影响不显著。

3 结论

考虑到溶剂毒性、成本及乙醇良好提取特性，选择乙醇作为为提取溶剂[17-18]，采用超声辅助提取，本研究通过单因素试验考察各提取因素对金耳香豆素的影响，利用正交试验对工艺条件进行优化，得出了金耳菌丝体总香豆素最佳提取工艺条件：采取50%乙醇、液料比25∶1、超声提取时间40 min、超声功率200 W，在此条件下，金耳菌丝体总香豆素的提取率达到0.85%。与传统醇提取法相比，超声波辅助提取耗时短、能耗低、提取率高且不易破坏提取物活性[19-20]，因此，其可用于金耳菌丝体香豆素的提取。该结果可为今后金耳菌丝体化学成分的进一步研究奠定基础。