封闭群实验用鸽微卫星DNA遗传检测方法的初步建立

王艺宁，刘新梦，章秀林，何 洋，张 玮，杜小燕，李长龙，陈振文

(首都医科大学基础医学院，北京 100069)

实验动物遗传质量直接影响实验结果的稳定性和真实性[1]。遗传质量检测是控制实验动物质量的有效手段之一，通过遗传检测，可对实验动物是否发生遗传突变和遗传污染进行分析，以确保实验动物符合该品种品系的遗传质量要求[2]。禽类具有繁殖快、饲养成本低、体外孵化容易、胚胎细胞易获得等优点，应用十分广泛，其中实验用鸡在疫苗研究和生产过程中发挥重要作用[3]。鸽(Columbaliviadomestica)作为另一种常用于科学研究的禽类实验动物，拥有繁殖性能佳、飞行能力强等生物学特性，在病毒学研究等方面发挥重要作用[4-5]。但是国内外关于实验用鸽的质量控制方法尚不完善，特别是在遗传质量控制方面，尚无检测方法，极大地限制了鸽在研究中的应用。

微卫星DNA(Microsatellite DNA)方法在实验动物遗传检测中应用广泛[6-10]。微卫星DNA又称简单重复序列(simple sequence repeat, SSR), 是指以1～6个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列。微卫星DNA在遗传检测方面具有以下优点：①在染色体上数量广泛且分布均匀，具有较好的代表性；②具有丰富的多态性，遗传信息量大；③易检测、结果稳定，重复性好；④具有共显性遗传，可用于鉴别杂合子和纯合子[11]。在本实验中，通过筛选分布均匀、扩增稳定、特异性好、多态性丰富的微卫星位点，初步建立了封闭群实验用鸽遗传检测方法，并对国内2个封闭群鸽群体进行了遗传分析，为封闭群实验用鸽种群遗传质量控制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

随机选取封闭群鸽白羽王和银王2个种群各40只，雌雄各半，日龄不限，所有动物来自北京市柳金龙肉鸽养殖场。动物均采用口腔屠宰法处死，后采集心脏组织，并置于-20℃冰箱冻存。所有实验均做到实验动物3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

PCR扩增仪(Bio-Rad公司，美国)。核酸电泳仪(PCR-30型，Bio-Rad公司，美国)。核酸凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)。超微量分光光度计(Nanodrop，美国)。蛋白酶K、Tris-饱和酚(北京索莱宝科技有限公司)。50 bp DNA marker、6× loading buffer(大连宝生物工程有限公司)。引物由北京天一辉远生物科技公司合成，荧光标记微卫星引物合成和STR扫描由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.3 实验方法

1.3.1 微卫星位点的选取

通过检索文献和利用SSR Hunter软件分析鸽基因遗传信息，获得用于进一步筛选的鸽微卫星位点。

1.3.2 样本DNA提取

利用酚-氯仿抽提法提取心脏组织的DNA。称量组织样本0.1 g捣碎，置于10 mL离心管中，加2 mL裂解液， 20 μL蛋白酶K，混匀后37℃震荡过夜，转速200 r/min。次日使用酚/氯仿抽提组织基因组DNA。提取得到的DNA用TE缓冲液稀释，使用超微量分光光度计检测DNA浓度，确定OD260/280均处于1.8～2.0范围内，并将所有DNA浓度均稀释为50 ng/μL，放置-20℃冰冻保存。

1.3.3 PCR体系和琼脂糖凝胶电泳初筛微卫星位点

PCR反应体系为20 μL，其中10 × Loading buffer 2 μL, 纯水(ddH2O): 7 μL，上下游引物(100 pmol/μL)：各1 μL，基因组DNA：1 μL，镁离子终浓度1.5 mmol /L。反应条件为：94℃预变性，5 min；94℃变性，30 s；适宜退火温度，30 s；72℃延伸，30 s；35个循环；72℃继续延伸7 min；扩增产物 -20℃保存。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳130 V，90 min，成相拍照。

1.3.4 STR扫描

对备选位点PCR扩增结果进行STR扫描。对引物上游进行荧光标记，分别为FAM、HEX、TAMRA 3种。运用合成的荧光引物对2个封闭群鸽基因组进行扩增, PCR反应条件遵循最终确定的优化条件，反应体系为20 μL。对扩增得到的样本送至公司进行STR扫描。

1.3.5 STR扫描结果的判读与统计分析

首先将表面温度源加热装置升温至温度点稳定后，使用表面温度计分别在图1中所示的五个测量位置，按照位置编号0-1-0-2-0-3-0-4-0的顺序，每隔1min测量一个位置点的温度，读数后迅速将表面温度计移至下一测量位置，共测一遍。然后将表面温源升温至下一个温度点，重复上述操作过程。

将最终的扫描结果导入Gene Marker软件，对出现的典型波形进行分析与归类：样本基因型若为纯合，则只有一个主波；样本若为杂和基因型，则有两个或以上主波。

1.4 统计学方法

整理由STR扫描得到的每个微卫星标记的基因片段大小，按照从小到大的顺序分别标记为a、b、c、d等。将从STR扫描得到的16个微卫星标记的基因型按照a a、a b等格式输入Popgene 3.2软件进行分析，并进一步计算观测等位基因数、有效等位基因数、香隆指数和有效杂合度等。将从Popgene 3.2软件中得到的各等位基因数及其在群体中的频率转换为PIC计算程序软件所需格式并导入，最终得到各位点PIC值。

2 结果

2.1 PCR反应条件的优化

通过检索文献和利用SSR Hunter软件分析鸽基因遗传信息，获得61个鸽微卫星位点。进行温度梯度PCR和琼脂糖凝胶电泳，根据条带的扩增特异性及扩增效率，明确61个位点的最适扩增条件。

2.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果以及微卫星位点的初筛

按照最适宜扩增条件对61个位点进行PCR扩增，并且将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从61个位点中筛选出长度适宜、多态性良好且特异性高的20个位点进行后续实验。以C26L10(1404758)位点为例，其琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

注：图1-A：白羽王群体1～23号DNA样本在位点C26L10(1404758)的琼脂糖凝胶电泳结果；图1-B：白羽王群体24～40号DNA样本以及银王群体1～6号DNA样本在位点C26L10(1404758)的琼脂糖凝胶电泳结果；图1-C：银王群体7～29号DNA样本在位点C26L10(1404758)的琼脂糖凝胶电泳结果；图1-D：银王群体30～40号DNA样本1～23号DNA样本在位点C26L10(1404758)的琼脂糖凝胶电泳结果。图1 80只鸽DNA样本在位点C26L10(1404758)的琼脂糖凝胶电泳结果Note. Figure 1-A， 1-23 DNA sample of WHITE KING population at site C26L10(1404758). Figure 1-B， 24-40 DNA samples from WHITE KING population and 1-6 DNA samples from SILVER KING population at site C26L10(1404758). Figure 1-C， the 7-29 DNA sample of SILVER KING population at site C26L10(1404758). Figure 1-D: the locus C26L10(1404758) of SILVER KING population DNA sample no. 30-40 (1-23).Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of 80 pigeon DNA samples at locus C26L10 (1404758)

2.3 STR扫描结果

将初筛后的20个位点进行STR扫描，并将最终得到的扫描结果导入Gene Marker软件，读出并记录波峰处扩增产物的片段长度。排除等位基因较少、波峰形状异常的位点后，最终筛选出16个多态性好、等位基因多且具有典型的Stutter峰的微卫星位点。位点信息如表1所示。

对比琼脂糖凝胶电泳得到的结果图，可见STR扫描在区分基因型方面有更高的敏感度，其得到的基因位点数目更加准确。以C26L10 (1404758)位点为例，STR扫描结果见下图2所示，16个微卫星位点名称、引物序列、最大等位基因数、等位基因范围及扩增条件见表1。

2.4 封闭群实验用鸽群体遗传分析

2.4.1 实验用鸽微卫星DNA位点分析

筛选出的的微卫星位点均在群体中呈现较好的多态性，16个位点共检测到136个等位基因。其中位点C26L1(20390)具有最高的观测等位基因数(16)，表明此位点具有最高的基因多样性。位点C26L10(1404758)的平均有效等位基因数(9.1176)、香隆指数(2.2806)及有效杂合度(0.8602)均最高，表明此位点在群体内个体间差异大、离散度高且群体具有较高的基因稳定性。此外，位点PG5具有最低的观测等位基因数，位点UU-Cli07具有最低的有效等位基因数、香隆指数及有效杂合度。16个位点在80个鸽DNA样本的观测等位基因数、有效等位基因数、香隆指数、有效杂合度、多态信息含量的具体信息见表2。

表1 16个微卫星位点名称、引物序列、最大等位基因数、等位基因范围及扩增条件

Table 1 Names, primer sequences, maximum allelic number, allelic range and amplification conditions of 16 microsatellite loci

位点名称Loci引物序列(5'-3')Primer sequence最大等位基因数The maximum number of alleles等位基因范围Allele range退火温度(℃) TemperatureMg离子浓度(mmol /L)MgCl2UU-Cli02TGGGCAAGGTACACTTTTAGGTCTTTATGCTCCCCCTTGAGAT5158～170611.5UU-Cli06TTTGAAAAACATGGATTGTGCAATTTGCAGAGGGTGAGTGG4140～145561.5PG5GTTCTTGGTGTTGCATGGATGCAGTTACGAAATGATTGCCAGAAG2262～266591.5C26L9(1265223)CAAAGCTGCTGACGTGAATCAAAGAGACGCTCCATGCAAAAG4467～472591.5UU-Cli14CAGAACGTTTTGTTCTGTTTGGTCTTGCTGCAGTCTTCATCC10265～292581.5C12L1(532572)GTTGTTTGGCTGAGTGGACGTCAACCAGGGGAATTGGCAG4126～136621.5C12L4(906353)GCTGCTGTCTTCTTCATTGGGTTAAAACCTCCCGTCTCCCTG11210～250601.5CliμD11CCAATCCCAAAGAGGATTATACTGTCCTATGGCTGAAGTG778～98581.5C26L10(1404758)GCTGTCAGGTATCAGCCACAATCAGACCCACGAAAGCTGTAA11211～226591.5C26L4(568923)CAACCCCATGTGGGTGAGACCACCACCACGTGGGACATC13357～432631.5PG4CCCATCTCCTGCCTGATGCCACAGCAGGATGCTGCCTGC10136～170641.5UU-Cli12CGCCAGACTGTATTGTGAGCAGCATGGCTGTTCTTTGAGG18231～265611.5CliμT47ATGTGTGTTTGTGCATGAAGATGAAAGCCTGTTAGTGGAA7183～214561.5CliμD32GAGCCATTTCAGTGAGTGACAGTTTGCAGGAGCGTGTAGAGAAGT9136～158601.5UU-Cli07GCTGCCTGTTACTACCTGAGCCTGGCCATGAAATGAACTCC5277～310611.5C26L1(20390)AGGAGCCTACACTGGGTTTTCTGTAGCTCTGCAATCAGCCT16250～268601.5

表2 80个鸽DNA样本在16个位点的观测等位基因数、有效等位基因数、香隆指数、有效杂合度、多态信息含量

注：图2-A：白羽王群体7号DNA样本在位点C26L10(1404758)所对应的STR图，杂合子，有两个波峰，分别为213 bp和219 bp；图2-B：白羽王群体36号DNA样本在位点C26L10(1404758)所对应的STR图，纯合子，有一个波峰，为219 bp。图2 白羽王群体部分DNA样本在位点C26L10 (1404758)的STR图Note. Figure 2A, STR diagram corresponding to the C26L10(1404758) of the DNA sample of WHITE KING population no.7. Heterozygote has two wave peaks, which are 213 bp and 219 bp, respectively. Figure 2B, The STR diagram corresponding to the locus C26L10(1404758) of the DNA sample no.36 of WHITE KING population. Homozygote, with a wave peak, is 219 bp.Figure 2 STR figure of part of the DNA sample of WHITE KING population at C26L10(1404758)

表3 银王与白羽王群体的平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均香隆指数、平均有效杂合度的比较

鸽子银王和白羽王群体是北京地区用于科学研究的两种主要实验用鸽群体。群体分析结果显示，银王和白羽王群体的平均有效杂合度均为0.6488；银王和白羽王群体的平均香隆指数分别为1.3072和1.4353。银王与白羽王群体的平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均香隆指数、平均有效杂合度的比较见表3。

3 讨论

3.1 研究目的

目前，随着我国生命科学领域科研水平的提高及研究内容的深入，人们越来越重视实验动物的遗传质量控制。与此同时，各学科对于实验动物品种和品系的需求也进一步加大。鉴于我国实验动物品种品系数量严重少于发达国家，这也成为桎梏我国生命科学和医药产业发展的重要瓶颈问题，丰富实验动物品种和品系的任务刻不容缓。

鸽是生活中常见的一种动物，在我国家禽养殖行业中有着广泛的市场和发展前景。在生物科学研究中，实验用鸽主要用于与病毒[12]、细菌[13]之间的相互作用以及目标导向的神经通路[14]相关方面的科学研究。由于鸽有着繁殖速度快、孵化周期短、饲养成本低等优点，其未来在疫苗研发、药物临床实验、疾病研究等领域有着巨大的潜在价值，对实验用鸽进行标准化研究对鸽在生命科学研究及生物制品生产和鉴定等领域的应用具有重要意义。

3.2 研究方法的选择

常用实验动物遗传质量检测方法有毛色基因测试法、生化标记基因检测法、免疫标记基因检测法、DNA 分子标记法等。前几种检测方法分别具有检测位点少，所需时间长、操作复杂、费用昂贵等缺点[1]。而DNA 分子标记可直接在 DNA 分子水平上检测生物间的差异, 能直接反映DNA 水平上的遗传变异，是如今被广泛应用的基因标记方法。其中微卫星DNA(STR)标记具有分布广泛、片段小、信息含量高、PCR放大后易分析、具有高度多态性等多种优点[15]，且已具有成熟技术。本研究中采用微卫星DNA标记法初步建立封闭群实验用鸽的遗传质量检测该方法。结果表明，该方法适于实验用鸽的遗传结构分析，可用于遗传质量检测。

3.3 关于群体的遗传多样性

群体的平均有效杂合度是群体遗传多样性的重要指标，可反映被检测基因的丰富度[16]。一般认为，当群体的平均有效杂合度低于0.5时，表明该群体内个体差异较小，遗传杂合度较低[17]，不符合封闭群动物遗传特征。当群体的平均有效杂合度处于0.5～0.7之间时，表明该群体没有受到高强度的选择，遗传多样性较为丰富[18]。当群体的平均有效杂合度高于0.7时，其遗传多样性偏高，若需要推广使用该群体，必须对其进行系统选育[19]，也不符合封闭动物群体遗传特征。本实验中银王群体和白羽王群体的平均有效杂合度均为0.6488，达到封闭群实验动物群体合格的量化标准，证实为两个理想的封闭群体。平均香隆指数是衡量微卫星多态性的重要指标，可表明所选微卫星位点整体多态性良好与否，本实验中银王和白羽王群体的平均香隆指数分别为6.125和7.375，表明所筛选位点的平均多态性良好。

在衡量基因变异程度高低时，多采用多态信息含量(PIC)作为变异指标，一般认为，当PIC 在 0.25 与 0.5 之间时为中度多态，当 PIC<0.25 时显示低度多态性，当 PIC 大于0.5时显示高度多态性[20]。在本研究中，除位点PG5与位点UU-Cli07处于中度多态之外，其余14个微卫星位点均处于高度多态，表明筛选出的位点中杂合子比例较大，所提供的遗传信息丰富[21]，可作为有效遗传标记。

本实验将PCR技术、琼脂糖凝胶电泳以及STR扫描技术结合在一起进行微卫星位点的优化。首先通过检索文献得到32个已报道的鸽微卫星位点[22-24]，此外还利用SSR Hunter软件结合PubMed搜索得到的鸽子DNA信息，筛选出29个微卫星位点。通过温度梯度PCR以及琼脂糖凝胶电泳的方法选出最适宜的退火温度，成功优化了PCR反应体系，筛选出20个微卫星位点。鉴于琼脂糖凝胶带电泳只能分辨10 bp以上的条带，本实验还利用STR扫描技术进一步确认琼脂糖凝胶电泳的检测结果，最终筛选出等位基因丰富、扩增效果明显，多态性良好的16个位点。

在筛选出微卫星位点后，本实验还对2个封闭群实验用鸽群体进行了遗传质量分析，结果显示16个位点均具有丰富的遗传多样性和较高的应用潜力。通过以上实验，本研究初步建立了实验用鸽微卫星DNA遗传检测方法，为实验用鸽遗传质量的标准化奠定了基础。