PTEN在多烯磷脂酰胆碱下调LPS诱导巨噬细胞炎症反应中的抑制作用

姜文清，戚 艳，沙若荷，章 欣，陈静越，潘 伟，孙芬芬*

(1.江苏省免疫与代谢重点实验室，病原生物学与免疫学教研室； 2.临床医学系； 3.基础医学国家级实验教学示范中心；徐州医科大学，江苏 徐州 221004)

磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline，PC)，亦称卵磷脂，是细胞膜和细胞器膜的重要组成部分[1]。传统用法上，PC作为一种保健品，具有安神补脑、美容养颜、减肥与清理血管内垃圾等功能。但新近发现该成分亦具有免疫调节作用[2-3]。研究证实，tuftsin-PC复合物可改善小鼠类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)病情，其机制可能与诱导调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)和调节性B细胞(regulatory B cells，Bregs)增多有关[4]；不仅如此，该化合物还可通过诱导DC细胞产生IL-10以改善小鼠炎症性肠炎病情[3]。

多烯磷脂酰胆碱(polyene phosphatidyl choline，PPC)，是一种护肝药，临床上广泛应用于各种肝病类型的治疗[5-8]，包括酒精所致肝纤维化、肝细胞脂肪变性及非酒精性脂肪性肝炎等。PPC的主要成分为PC，提示PPC可能具有抗炎作用。课题组前期研究发现PPC可下调LPS诱导的巨噬细胞(macrophages， Mø)炎症反应，并能改善大鼠类风湿性关节炎病情[9]。这提示PPC具有治疗炎性疾病的潜力。深入探讨PPC的作用机制将为开发PPC作为抗炎药提供理论基础，但目前尚不明确。

第10号染色体缺失的张力蛋白-磷酸酶同系物 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，是1997年人类发现的第一个具有磷酸化酶功能的抑癌基因[10]。其编码蛋白可调控细胞生长发育、凋亡、迁移、信号传递等[11-12]。那么，PTEN是否参与了PPC的抗炎过程，尚不明确。本研究以小鼠Mø系Raw264.7为模型，探讨PPC对LPS诱导Mø炎症的调控作用以及PTEN在上述过程中的作用，研究结果将为开发PPC作为抗炎药奠定实验依据。

1 材料和方法

1.1 巨噬细胞细胞系

Raw 264.7细胞株由本实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/HIGH Glucose培养基 (美国Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)，PTEN及β-actin抗体(英国Abcam公司)，抗兔二抗(武汉ABclonal公司)，小鼠IL-6、IL-10、TNF-α ELISA检测试剂盒(美国eBioscience公司)，多烯磷脂酰胆碱注射液(赛诺菲安万特(北京)制药有限公司)，PrimeScriptTMRT Master Mix(日本Takara公司)，TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京金式全生物有限公司)，LPS (美国Sigma公司)，SF1670(PTEN抑制剂，美国ApexBio公司)，ECL化学发光试剂盒(德国Millipore公司)，青霉素、链霉素溶液(美国Gibco公司)。

荧光定量PCR仪(德国Roche Light®Cycler480Ⅱ)，分光光度计(Nanodrop Lite)，酶标仪(美国Biotek酶标仪)，Western blot电泳湿转系统(美国Bio-Rad公司)，CO2细胞培养箱(德国Thermo Scientific)，TRIzol(碧云天)。

1.3 实验方法

1.3.1 巨噬细胞系培养

RAW264.7细胞以5×105/mL铺于6孔板，每孔2 mL完全培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL)。于37℃、5% CO2培养箱中进行培养及实验。

1.3.2 实验分组

(一)PPC对LPS诱导Mø炎症反应的调控作用研究

实验分为4组：PBS组、PPC组(20 μg/mL)、LPS组(100 ng/mL)、LPS(100 ng/mL)+PPC(20 μg/mL)组。每组3个重复孔。加入上述刺激培养24 h后，收集上清后，向细胞中加入Trizol，反复吹打，待细胞裂解充分后，收集细胞裂解液。以上样本置于-80℃冰箱备用。

(二)PTEN在PPC调控LPS诱导Mø炎症反应中的作用研究

实验分为6组：PBS组、PPC组(20 μg/mL)、LPS组(100 ng/mL)、LPS(100 ng/mL)+ PPC(20 μg/mL)组，PPC(20 μg/mL) + SF1670 (150 ng/mL)、LPS(100 ng/mL)+ PPC(20 μg/mL)+ SF1670 (150 ng/mL)。每组3个重复孔。加入上述刺激培养24 h后，样本收集同前。

1.3.3 实时荧光定量RT-PCR检测IL-6 mRNA表达情况

收集上述各组TRIzol裂解细胞，抽提RNA，用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒反转录cDNA后，运用实时荧光定量PCR检测IL-6 mRNA表达情况。引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系(20 μL 体系)为：上游引物：10 μmol/L，1 μL；下游引物：10 μmol/L，1 μL；SYBR Green Ⅰ：10 μL；ddH2O: 7 μL； cDNA：1 μL。荧光定量PCR扩增条件为：预变性95℃ 5 min；PCR反应95℃ 15 s，60℃ 15 s，75℃ 15 s，共45个循环。以GAPDH作为内参，校正目标基因的表达量，应用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。

表1 用于实时荧光定量RT-PCR的引物序列

1.3.4 Western blot检测PTEN表达

收集各组细胞沉淀，加入RIPA裂解液后，抽提总蛋白，定量后，进行蛋白电泳及转膜。转膜后，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别用稀释浓度为1∶1000的PTEN、β-actin抗体孵育4℃过夜。Washing buffer洗3次，每次15 min。稀释度为1∶5000抗兔二抗室温孵育2 h，washing buffer洗3次，每次15 min，ECL显影后用Image Lab软件进行图片分析。

1.3.5 ELISA检测测炎症相关因子蛋白含量

采用美国eBioscience公司 ELISA试剂盒检测培养上清中IL-6、IL-10、TNF-α水平。具体操作按照说明书进行。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 PPC对LPS诱导Mø炎症因子的影响

为探讨PPC对炎症反应的调控作用，用ELISA检测培养上清中炎症相关因子的含量(图1)。PPC组TNF-α、IL-6、IL-10的含量分别为(26.007±7.764)pg/mL、(15.181±5.619)pg/mL、(138.809±44.789)pg/mL，与PBS组的(17.827±3.704)pg/mL、(10.565±1.709)pg/mL、(153.822±14.277)pg/mL，无明显统计学差异(P>0.05)。LPS+PPC组炎症相关因子TNF-α、IL-6的含量分别为(87.977±13.374)pg/mL、(109.875±11.029)pg/mL，显著低于LPS组炎症相关因子含量(561.402±42.748)pg/mL、(686.887±37.841)pg/mL(P<0.001)，而LPS+PPC组IL-10为(3433.795±302.731)pg/mL，显著高于LPS组的(1105.894±92.478)pg/mL(P<0.001)。以上结果表明，PPC能显著抑制LPS诱导的Mø炎症反应。

注：图中四组bar依次代表巨噬细胞经过PBS、LPS、PPC、LPS+PPC处理后上清中TNF-α、IL-6及IL-10的含量。与LPS 组比较，**P<0.01; ***P<0.001。图1 PPC对LPS诱导Mø细胞炎症因子分泌的影响Note. The four groups of bars in the figure show the content of TNF-α,IL-6 and IL-10 in supernatant of macrophages treated with PBS, LPS, PPC and LPS+PPC. Comapred with the PPC group，**P<0.01; ***P<0.001。Figure 1 The effects of PPC on the secretion of inflammatory cytokines in macrophages induced by LPS

2.2 PPC对LPS活化Mø 细胞中PTEN表达的影响

为探讨PPC调控炎症的信号通路，利用Western blot检测上述各组PTEN蛋白表达情况(图2)。相比PBS组，LPS组PTEN表达下降(P<0.05)；PPC组PTEN表达升高(P<0.001)。相对LPS组，PPC+LPS组PTEN表达量显著升高(P<0.001)。以上结果提示，PPC可能通过作用于上调PTEN抑制LPS诱导的Mø炎症反应。

注：图中A代表性Western blot,图中B四组bar依次代表巨噬细胞经过PBS、LPS、PPC、LPS+PPC处理后PTEN的相对表达量。与LPS 组比较，**P<0.01; *** P<0.001。图2 PPC对LPS活化Raw264.7细胞中PTEN表达的影响Note. Figure 2A, Western blot. Figure 2B, The relative expression of PTEN in macrophages treated with PBS, LPS, PPC and LPS+PPC. Comapred with the PPC group, **P<0.01; ***P<0.001.Figure 2 The effects of PPC on the PTEN expression of Raw 264.7 cells activated by LPS.

2.3 SF1670对PPC调控Mø炎症因子的影响

为明确PTEN是否参与PPC下调LPS诱导的Mø炎症反应，向上述培养体系中加入PTEN抑制剂SF1670，ELISA及实时荧光定量RT-PCR检测炎症因子的表达变化(图3)。PPC+SF1670组TNF-α含量为(42.286 ± 5.737) pg/mL，显著高于PPC组(P<0.05)；PPC组为IL-6相对表达量为(1.690 ± 0.251)，显著低于PPC+SF1670组的(29.627 ± 6.469)(P<0.001)；而PPC组IL-10含量与PPC+SF1670组无明显差异(P>0.05)。PPC+LPS+SF1670组TNF-α含量为(786.876±234.499) pg/mL，显著高于PPC+LPS组的(165.310 ±40.763) pg/mL(P<0.05)； PPC+LPS+SF1670组IL-6的表达量为(316.695±23.262)，显著高于PPC+LPS组(P<0.001)； PPC+LPS+SF1670组IL-10含量为(2869.317±106.722) pg/mL，显著低于PPC+LPS组的(5100.46 ±856.631) pg/mL(P<0.05)。以上结果表明，PTEN参与了PPC下调LPS诱导Mø炎症反应。

3 讨 论

本研究发现PPC能下调LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，并证明PTEN参与PPC的抗炎作用。作为一种经典护肝药物，近些年来发现PPC也可治疗重症胰腺炎[13]、急性脓毒症[14]、类风湿性关节炎[3]等非肝脏疾病；但其抗炎机制需进一步探讨。

注：上清中TNF-α、IL-10的含量及细胞中IL-6的相对表达量。与LPS+PPC 组比较，**P<0.01; *** P<0.001。图3 PTEN抑制后PPC对LPS诱导Mø细胞炎症反应的影响Note. The content of TNF-α and IL-10 in supernatant and relative expression of IL-6 in macrophages. Comapred with the LPS+PPC group，**P<0.01; *** P<0.001。Figure 3 The effects of PPC on LPS induced inflammatory response in macrophages after inhibition of PTEN

本研究发现，PPC并不会诱导正常Mø细胞产生炎症反应，与课题组前期报道PPC对Mø细胞的增殖与凋亡均无明显影响相符[9]。但PPC能明显抑制LPS诱导的Mø细胞释放促炎因子IL-6、TNF-α的分泌，并促进抗炎因子IL-10的分泌。在Mø细胞炎症反应中，TNF-α 与IL-6 是主要的炎性因子。其中，TNF-α可通过介导T细胞的激活与增殖来促进炎症反应，而IL-6可通过淋巴细胞的激活与增值、B细胞的分化、白细胞的募集以及肝内急性蛋白反应来促进炎症活动，从而在炎性疾病发生发展中发挥着重要作用[15]。IL-10主要由单核细胞和淋巴细胞产生，被认为是最重要的抗炎因子之一[16]。目前，针对IL-6、TNF-α的抗体及受体阻断剂已被开发用于治疗自身免疫性疾病[17-18]。本研究结果提示，PPC具有较好的抗炎潜力，可能用于治疗炎性疾病。

本研究还证实，PPC发挥抗炎作用与其上调PTEN有关。PPC能显著上调Mø细胞PTEN表达，而采用抑制剂SF1670抑制PTEN表达，PPC不能下调LPS诱导的炎症反应。有研究显示，PTEN可通过催化3, 4, 5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)去磷酸化拮抗PI3K活性[19]，下调PI3K/AKT通路从而抑制下游信号分子NF-κB与mTOR的激活[20-21]。PI3K是由一个催化亚基(p110α/β/γ/δ)和一个调节亚基(p85α/β)组成的杂二聚体蛋白[22]。在细胞被生长因子或细胞因子激活后，PI3K催化D3位的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)转化生成PIP3。AKT通过血小板同源结构域(pleckstrin homology domain, PH domain)与PIP 3结合，引起AKT构象的改变，随后AKT在Ser473/474被磷酰肌醇依赖性激酶2(phosphoinositide-dependent kinase-2, PDK-2)激活[23]。AKT能激活多种基因的转录，特别是那些参与免疫激活、细胞增殖、凋亡和细胞存活的基因。已有研究证明PI3K/AKT参与NF-κB活化及NF-κB依赖性细胞因子的表达，激活各种炎症基因的转录，促进炎症因子生成，诱发炎症反应[24]。此外，下调PI3K/AKT信号轴也可能促进Mø细胞向M2型分化[25]。在CCl4诱导小鼠肝纤维化进展逆转模型中，PTEN可以下调PI3K/AKT/STAT6信号通路，促进巨噬细胞向M2型分化[26]。结合前人研究，本研究推测PPC可能通过上调PTEN表达，下调PI3K/AKT通路，以抑制Mø细胞释放炎症因子，但具体机制尚需进一步证实。