实验用鸡的遗传检测方法的初步建立

崔爱缺，宫昳頔，章秀林，何 洋，张 玮，韩凌霞，陈继兰，李长龙，陈洪岩*，陈振文*

(1.首都医科大学基础医学院，北京 100069； 2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150069； 3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

在禽类实验动物中，鸡在生命科学研究和医药产业中应用最为广泛。目前，北京SPF鸡胚的年产量约840万枚，非免疫鸡胚也超过24万枚。实验动物遗传质量控制是科学研究结果可靠性和准确性的重要保障，也是相关生物制品质量的重要保证。从遗传学方面来说，目前我国的实验用鸡有封闭群和主要组织相容性复合体(MHC)单倍型两种遗传特征[1-2]。封闭群是一个远交群体，繁育过程中应保持基因异质性和多态性，繁殖方法应避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升。单倍型实验用鸡主要关注的是个别或部分基因的同质性，繁殖方法采用全同胞或半同胞的繁殖方式。遗传特性和繁殖方式决定了不同群体的遗传质量要求[3]。

微卫星DNA(microsatellite DNA)又称短串联重复(short tandem repeats，STR)，其包括核心序列和侧翼序列两部分，核心序列是以1～6个碱基为单位的DNA重复序列，重复次数一般不超过60次[4-5]。微卫星具有信息含量高、基因组分布广泛、高度多态性、测定简单快捷等特点，已经成为应用范围最广的分子标记[6-7]。目前我国已经建立封闭群BWEL鸡的微卫星DNA的遗传检测方法以及MHC鸡的测序检测方法[3,8]。我国鸡的品种非常丰富，应用于科学研究和生物制品生产检定的品种也很丰富[9]。本研究采用不同遗传背景的多种实验用鸡，研究探索实验用鸡微卫星DNA遗传检测方法，将为实验用鸡遗传质量控制以及其他鸡品种的遗传结果分析提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验采用3个封闭群实验用鸡和3个单倍型鸡群体。封闭群BWEL-SPF鸡，样本40个，37周龄，其中6♂34♀，来自白来航鸡血统[SCXK(黑)2017-005]，目前已封闭饲养20世代；封闭群BM鸡样本40个，14周龄，其中6♂34♀，来自白来航鸡血统[SCXK(黑)2017-005]；封闭群北京油鸡样本46个；MHC单倍型鸡选育自第13代BWEL鸡群，根据MHC核心基因连续选育单倍体型，已采用半同胞兄妹交配方式繁殖至第8代，本次检测抽取了G1单倍型鸡样本5个，53周龄，其中1♂4♀；G2单倍型鸡样本5个，93周龄，其中1♂4♀；G7单倍型鸡样本5个，82周龄，其中1♂4♀。北京油鸡样本来源于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，其余群体的血液样本来源于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心暨国家禽类实验动物资源库。所有实验做到实验动物3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

PCR扩增仪(ALS1296型，美国Bio-Rad公司)。电泳仪(PCR-30型，美国Bio-Rad公司)。血液基因组DNA提取试剂盒(Cat.#DP318-03)购于天根生化科技(北京)有限公司，蛋白酶K购于北京索莱宝科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP购于大连宝生物工程有限公司；微卫星引物、荧光标记微卫星引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。STR扫描由北京天一辉远生物科技有限公司完成。

1.3 实验方法

1.3.1 选取微卫星位点

通过文献检索和遗传信息分析，筛选染色体均匀分布均匀、扩增效果好、多态性好、等位基因明确位点[10-12]，用于下一步的实验筛选。

1.3.2 鸡血液样本DNA的提取

使用血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit)进行北京油鸡血液样本DNA的提取，采用紫外分光光度计和0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的浓度和纯度，所有DNA浓度均稀释为 50 ng/μL放置-20℃保存。

1.3.3 PCR反应条件优化和琼脂糖凝胶电泳初筛

每个微卫星位点引物合成后进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL，10× buffer 2 μL，上下游引物(100 pM)各 1 μL，4× DNTP (100 μmol/L) 1 μL，Taq DNA聚合酶1 U 1 μL，基因组DNA(50 ng/μL)1 μL，纯水(ddH2O) 15 μL，扩增时进行温度梯度扩增，扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；适宜退火温度30 s；72℃延伸30 s；35个循环；72℃继续延伸7 min；扩增产物4℃保存。取扩增产物5 μL与1 μL的6×loading buffer混合后置于2%的琼脂糖凝胶电泳中，120 V，60 min，拍照成像。根据电泳图，挑选出扩增效率高、特异性好的位点保留，并记录条带最清晰时对应的最适温度。

1.3.4 荧光标记与STR扫描

用FAM、HEX、TAMAR3种荧光标记分别标记初步筛选位点的上游引物5’端。用标记好的荧光引物对3个封闭群鸡和3个单倍型鸡的基因组DNA进行PCR扩增，将扩增好的PCR产物送往北京天一辉远生物科技有限公司进行STR扫描。

1.3.5 统计分析STR扫描结果

将最终的扫描结果导入Gene Marker V2.2.0软件，对于出现的典型波形进行分析与归类：样本基因型若为纯合，则只有一个主波; 样本若为杂和基因型，则有两个或以上主波。

1.4 统计学方法

利用Gene Marker V2.2.0 软件读出6个群体样本在每个微卫星位点的扩增片段大小，并将每个位点的等位基因按照扩增片段由小到大的顺序分别标记为A、B、C、D等，将其基因型按照AA、AB等格式输入popgene 3.2软件进行分析，得到在每个微卫星位点上的观测等位基因数、有效等位基因数、香隆指数和有效杂合度等信息[13]。利用PIC计算程序软件计算多个位点的多态信息含量，将从popgene 3.2软件中得到的每个位点的等位基因数以及等位基因在群体中的频率输入记事本中，建立一个扩展名为dat的文本文件，将该文件导入PIC计算程序软件中可得到位点PIC值。

2 结果

2.1 微卫星位点的PCR初步筛选

通过文献检索和基因信息分析，共计获得72个微卫星位点。在琼脂糖凝胶电泳中出现特异性的条带共计58个位点，其条带范围为50～350 bp。封闭群位点初筛最终选出多态性较好的37个微卫星位点。在单倍型中选出单态性好的32个微卫星位点。以LEI0094位点为例，结果如图1所示，LEI0094位点在封闭群中呈现多态，在单倍型群体中为单态出现。

注：图1-A：位点LEI0094在北京油鸡样本的琼脂糖凝胶电泳结果；图1-B：位点LEI0094在G1样本的琼脂糖凝胶电泳结果。图1 实验用鸡微卫星DNA位点LEI0094的琼脂糖凝胶电泳结果Note. Figure 1A， LEI0094 in closed group of Ⅲ. Figure 1B， LEI0094 in inbred line G1.Figure 1 Results of agarose gel electrophoresis of microsatellite DNA locus LEI0094 in the experimental chickens

2.2 STR分析

将琼脂糖凝胶电泳初筛获得位点进行STR 扫描，并且将最终的扫描结果导入Gene Marker软件，读出并记录波峰处的扩增产物的长度。排除等位基因较少、波峰形状异常的位点后，最后确定用于封闭群遗传检测位点28个，用于单倍型遗传检测的位点14个，其中共用位点13个。其中GGVITC位点为共用位点，其在封闭群中为多态，存在122 bp、140 bp和146 bp的片段；在单倍型三个群体中均呈现为单态，但是在三个群体间存在差异，在G1群体中为150 bp的片段，在G2群体中为142 bp的片段，在G7群体中为146 bp的片段，结果如图2所示。位点ADL0292在G1、G2群体中为单一峰，分别呈现128 bp和124 bp的片段，在G7群体中存在明显双峰，呈现120 bp和126 bp的片段。所有微卫星DNA位点信息见表1。

2.3 群体遗传分析

2.3.1 群体位点分析

将从STR中得到实验用鸡的位点信息输入popgene 3.2后分析得到实验用鸡样品在封闭群和单倍型的29个位点上的观测等位基因数、有效等位基因数、有效杂合度及香隆指数。在封闭群中，28个微卫星位点均表现出高度多态性，平均观测等位基因数为7.9643个，其中LEI0141位点和LEI0094位点最高为16个，GGVITIIG*位点和GGNCAMZO位点最低为2个；平均有效等位基因数为4.9459个，其中LEI0141位点最高为9.3284个，GGVITIIG*位点最低为1.8349个；平均香隆指数为1.667，其中LEI0141位点最高为2.4409，GGVITIIG*位点最低为0.6474，表明在封闭群中，筛选位点的遗传多样性较好，且各位点的遗传多样性差别较大；平均有效杂合度为0.563，MCW0347位点最高为0.833，ADL0201位点最低为0.2183，表明群体中杂合度差异大，多数位点存在两个及两个以上等位基因。具体信息见表2。

表1 用于实验用鸡遗传检测的29个微卫星位点

(续表1)

位点Loci引物序列(5'-3') Primer sequence 退火温度(℃)Temperature等位基因数Allele number 等位基因范围Allele range 适用群体Applicable groupsADL0201GCTGAGGATTCAGATAAGACAATGGCYGACGTTTCACAGC58.55151～179封闭群MCW0402ACTGTGCCTAGGACTAGCTGCCTAAGTCTGGGCTCTTCTG56.07177～203封闭群单倍型STMSGGHU2-1ACTTAATATGTGTGAGGTGGCGTTCTCACAATTGCATTAGC53.93158～165封闭群单倍型

表2 封闭群实验用鸡样品的观测等位基因数、有效等位基因数、有效杂合度、PIC和香隆指数

注：图2-A：位点GGVITC下封闭群动物中表现为多态，分别为122 bp和146 bp；图2-B：位点GGVITC下单倍型G1动物中表现为150 bp单态；图2-C：位点GGVITC下单倍型G2动物中表现为142 bp单态；图2-D：位点GGVITC下单倍型G7动物中表现为146 bp单态。图2 实验用鸡微卫星DNA位点GGVITC的STR扫描结果Note. Figure 2A， The STR diagram corresponding to the sample of closed group under primer GGVITC shows heterozygote with two wave peaks of 122 bp and 146 bp, respectively. Figure 2B, The STR graph corresponding to the sample of haploid type under primer GGVITC shows homozygote with a wave peak of 150 bp. Figure 2C, The STR graph corresponding to the sample of haploid type under primer GGVITC shows homozygote with a wave peak of 142 bp. Figure 2D, The STR graph corresponding to the sample of haploid type under primer GGVITC shows homozygote with a wave peak of 146 bp.Figure 2 Results of GGVITC scan of the experimental chekens

在3个单倍型群体中，14个微卫星位点均表现出一致的单态性，平均观测等位基因数为2.0714个，STMSGGHU2-1A位点最高为3个，其余位点均为2个，主要由于单倍型3个群体中位点一致性良好，但3个群体间存在差异；平均有效等位基因数为1.6972个，STMSGGHU2-1A位点最高为2.1778个，MCW0402位点最低为1.3243个；平均香隆指数为0.5995，STMSGGHU2-1A位点最高为0.876，MCW0402位点最低为0.4101，表明位点遗传多样性差，各位点遗传多样性相近；平均有效杂合度为0.3794，STMSGGHU2-1A位点最高为0.4983，MCW04021位点最低为0.2317，表明杂合度差异较小，所选位点的遗传信息较为单一。具体信息见表3。

2.3.2 群体遗传结构分析

在3个封闭群中，北京油鸡平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均香隆指数和平均有效杂合度均最高，表明北京油鸡群体多样性最好。BM种群中平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均香隆指数均最低，平均有效杂合度与BWEL均为0.5566。表明BM种群多样性最低(表4)。

在单倍型群体中，单倍型G2、G7平均观测等位基因数最高为2个，单倍型G1最低为1.8571个，三个群体内异质性较好，但是群体间存在一定的差异，主要受其繁殖方式(全同胞或半同胞)的影响。单倍型G2平均有效等位基因数最高为1.7243个，单倍型G1最低为1.6154个。单倍型G7平均香隆指数最高为0.5881，单倍型G1最低为0.5108。单倍型G1、G2、G7平均有效杂合度均为0.3794。3个群体的遗传杂合度很低且一致性好(表5)。

3 讨论

3.1 研究方法与分型方法的选择

从DNA水平研究生物遗传多样性有多种研究方法，微卫星DNA、线粒体DNA(mtDNA)、限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)和特定基因多态性等方法。赵献芝等[14]采用将微卫星标记与荧光标记引物测序相结合的技术研究了重庆地方鸡品种的遗传多样；武艳平等[15]利用mtDNA的D-loop 区来分析江西地鸡品种的群体结构、网络关系及系统进化情况；周敏等[16]采用此方法对4个鸡品种进行VIPR-1 基因遗传多样性分析；常国斌等[17]运用该方法检测鸡A-FABP基因的SNP及后代分离群体不同基因型的时空表达规律。微卫星DNA具有多态性高、共显性遗传和高分辨率等特点，且微卫星标记较之其他方法如PCR-SSCP，有着操作简单、分析程序简洁、研究所需DNA量较小等优势，故而本研究选择采用微卫星DNA分子标记技术。

在微卫星多态性分析中，分型方法主要包括琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) -银染法、荧光标记引物测序法[18]。琼脂糖凝胶电泳操作简便、快速, 但是分辨率不高；PAGE-银染法分辨率高，操作繁琐，受其他因素影响大，而且在进行大批量样本和标记分型时工作量大；荧光标记引物测序法，可以克服肉眼分辨能力不客观等缺点，得到更加清晰的图谱和准确的分析结果，快捷准确，真正实现了高通量与自动化的结合，试验周期短，结果理想。另外，对于MHC单倍型鸡的判定还可以采用PCR结合直接测序法，这种方法针对MHC核心区域的2个片段进行扩增并测序对比[3]，适用于部分序列高度一致的群体，但此种方法对实验仪器设备要求较高。因此，分析对比各种分型方法的优缺点并结合本实验的实际情况，本实验选择荧光标记引物测序法。

表3 单倍型实验用鸡样品的观测等位基因数，有效等位基因数，有效杂合度和香隆指数

表4 鸡封闭群群体的平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均香隆指数、平均有效杂合度的比较

表5 单倍型鸡群体的平均观测等位基因数、平均有效等位基因数、平均香隆指数、平均有效杂合度的比较

3.2 杂合度与多态信息含量

杂合度是度量群体遗传变异的一个参数。张剑等[19]利用29对微卫星标记对北京油鸡保种群192个个体进行了遗传多样性检测，发现29个微卫星中有19个位点呈高度多态，且平均期望杂合度为0.59。本研究中，封闭鸡群的平均期望杂合度为0.56，其中北京油鸡的平均期望杂合度为0.5630，与张剑等人研究结果相似，这也进一步证明北京油鸡具有丰富的遗传多样性和较高的选择潜力，可能是由于北京油鸡群体较大等原因导致。在本研究中3个单倍群体中平均有效杂合度均为0.3794，表明单倍型实验用鸡群体一致较好。这由于长期的全同胞和半同胞繁殖的结果。

多态信息含量(PIC)是衡量基因变异程度高低的一个指标，多态信息含量越高，基因座所提供的遗传信息就越多[20]。本研究中，封闭群28个微卫星座位中有26个位点处于高度多态，2个位点为中度多态，无低度多态位点。28个微卫星座位的平均PIC为0.7162，能够为评价实验用鸡的遗传多样性提供充分的信息。在3个单倍型群体中，所采用的14个位点中13个位点均表现为单态，只有1个位点表现为多态，说明单倍型群体产期的近交繁育使得其遗传背景高度一致化。但是13个呈现单态的位点在单倍型群体间也存在差异，表明不同单倍型群体间依然存在不同。

实验用鸡的遗传质量控制对生命科学研究和生物制品生产具有非常重要的意义。本研究中选择3个封闭群实验用鸡群体和3个单倍型鸡群体，通过PCR、琼脂糖凝胶电泳法和STR方法筛选，初步建立封闭群和单倍型实验用鸡的微卫星DNA的遗传检测方法，并在3个封闭群和3个单倍型实验用鸡的群体中进行了应用。本研究建立的微卫星DNA检测方法适用于实验用鸡的遗传质量检测。