双酶水解鸡副产物制备蛋白胨工艺的优化

潘风光 侯力箫 王 莹 刘静波

（吉林大学食品科学与工程学院营养与功能食品研究室 长春130062）

我国是肉鸡生产大国，据统计，2014年我国肉鸡产量已高达1 380 万t，占到全球总产量的15%以上[1-2]。在这种大量生产的情况下，产生了大量的以头、皮、腿、脚、骨头、内脏、羽毛、粪便等形式的固体废弃物，统称为鸡副产物[3]。鸡副产物中含有大量的营养因子，然而目前利用率较低，多数被弃于环境中，对鸡副产物进行深入研究，制备具有高附加值的产品，不但能够降低废弃物不当处理造成的环境污染，还能提高副产物综合利用价值，拓展其应用领域[4-5]。

蛋白胨是蛋白质经水解分离纯化后得到的一组混合物，可供作细菌培养基用，提供微生物生长过程中的主要N 源、C 源及生长因子[6]。其产品在医药行业、发酵工业、生物化工等领域均有较大的应用价值[7-8]，同时也是大米、面粉、酱油及各种保健食品中蛋白质的添加剂。目前我国关于蛋白胨产品的研究较少，大部分集中在植物蛋白胨的研究，对动物副产物加工利用领域研究不足，而用鸡副产物加工制备蛋白胨的研究更少。大量高营养的鸡副产物为蛋白胨的制备提供了丰富的原料来源。

在已有研究的基础上，采用双酶水解方法，通过二次通用旋转组合设计优化鸡副产物制备蛋白胨工艺，减少试验次数[9-10]，旨在提高资源利用率，为微生物生长提供所需的营养物质。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

脱脂鸡副产物（干重比鸡骨∶鸡内脏=3∶1），其中鸡内脏干重比为鸡皮∶鸡肝∶鸡胗=1∶1∶1，吉林德惠食品有限公司；胰蛋白酶、碱性蛋白酶，美国Sigma 公司；标准蛋白胨，北京奥博星生物技术有限公司；酪素，上海永瑞生物科技有限公司；L-酪氨酸，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；氢氧化钠、盐酸、甲醛、酒石酸钾钠、硫酸铜、碘化钾、福林酚、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为分析纯级。

JJ-1 型精密定时电动搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；STARTEER 300 型奥豪斯pH 计，上海泉佰仪器有限公司；CP124C 型电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司；UV-2550 型紫外-可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；DK-8D 型数显恒温水浴锅，江苏金坛荣华仪器制造有限公司；CR20B2 型高速冷冻离心机，日本Hitachi 公司；DW-86L388A 型超低温冰箱，青岛海尔特种电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 电位滴定法测定氨基态氮 按照GB/T 5009.39-2003 方法，采用电位滴定法测定氨基态氮。

1.2.2 水解度的测定

1.2.3 蛋白胨含量的测定 采用双缩脲法。

1.2.3.1 试剂的配制

1） 标准蛋白胨溶液 精确称取0.5 g 干燥至恒重的细菌学蛋白胨，用30%NaOH 溶液0.5 mL和蒸馏水3 mL 使其充分溶解，加水定容100 mL，即5 mg/mL 的标准蛋白胨溶液[11]。

2）双缩脲试剂 溶解4.5 g 酒石酸钾钠于20 mL 0.2 mol/L NaOH 溶液中，加0.5 g 硫酸铜（Cu-SO4·5H2O），待溶解后，加入0.5 g 碘化钾，用0.2 mol/L NaOH 溶液稀释至100 mL，密封保存备用。

1.2.3.2 操作步骤

1） 标准曲线的绘制 分别取标准蛋白胨溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4，2.7，3.0 mL 于11 只试管中，蒸馏水补足至3.0 mL，分别加入3.0 mL 自制的双缩脲试剂后混合均匀。以零管作空白，在540 nm 处比色测定，记录吸光度。每支试管做平行试验3 次。

2） 样品测定 将样品稀释至蛋白胨含量约为4～5 mg/mL，取稀释样品1 mL，用蒸馏水补足至3.0 mL，加入3.0 mL 双缩脲试剂，混匀，用蒸馏水作空白，于540 nm 处进行比色测定[12]，记录吸光度。

注意：1）、2）步骤在30 min 内完成，否则会产生雾状沉淀。

1.2.3.3 计算 由标准曲线得出稀释后样品的质量浓度为C（mg/mL），原样品中蛋白胨质量浓度为Cpept，则：

Cpept=C×稀释倍数

式中：Cpept——水解液中蛋白胨含量，mg/mL；V——水解液体积，mL；M——水解液中原料干物质质量，g。

1.2.4 蛋白酶活力的测定 采用Folin-酚法。

1.2.4.1 福林试剂稀释液的制备 将福林试剂与蒸馏水按照1∶2 的比例混合均匀，即福林试剂稀释液。

1.2.4.2 L-酪氨酸标准曲线的绘制

1） 100 μg/mL L-酪氨酸标准溶液配制方法根据福林法测酶活，按照文献[12]的方法配制标准溶液，具体操作见表1。绘制出L-酪氨酸标准曲线，根据所得线性方程计算吸光度常数K 值。其中K 值应在95～100 范围。

1.2.4.3 蛋白酶活力的测定 分别称取1～2 g 蛋白酶，用少量对应缓冲液溶解后，测定酶活力。按表2操作步骤进行，最后在波长680 nm 处测定吸光度值。

表1 L-酪氨酸标准溶液的配制Table 1 Preparation of L-tyrosine standard solution

表2 酶活力测定加样顺序Table 2 The sample order of enzyme activity determination

1.2.5 双酶水解制备蛋白胨工艺研究 对鸡副产物按照超声波辅助碱法提取蛋白[13]。称取定量的蛋白提取物，按照液固比4∶1 加入蒸馏水使其浸泡充分，用pH 计测定pH，加入6 000 U/g 的蛋白酶使其充分酶解，用0.1 mol/L NaOH 溶液及0.1 mol/L HCl 调节溶液的pH 值。结束后将溶液置于90 ℃水浴中灭酶10 min[14]。所得酶解液在4 000 r/min 离心10 min，取上清液测定其水解度及蛋白胨得率。接着，在40 ℃，以30 r/min 的转速将水解上清液旋转蒸发浓缩，之后，将浓缩液真空冷冻干燥，过120 目筛，得到蛋白胨粉末。

1.2.6 二次通用旋转组合优化双酶水解工艺设计根据单因素试验结果，以蛋白胨得率为响应值，选择双酶配比（碱性蛋白酶：胰蛋白酶）（X1）、酶解温度（X2）、酶解pH（X3）、酶解时间（X4）4 个试验因素，进行四元（1/2 实施）二次通用旋转组合试验设计，试验方案如表3所示，用DPS 分析软件优化最佳酶解条件。

表3 四元二次通用旋转组合设计因素水平表Table 3 Factors and levels of quadratic general rotary unitized design

2 结果与分析

2.1 酶活力测定结果

2.1.1 酶活力测定标准曲线 由图1可知L-酪氨酸标准曲线的回归方程为y=0.0102x+0.0016，可计算出当OD680值为1 时酪氨酸的量，即吸光度常数K 值，K=97.88。

本试验所用蛋白酶实际酶活力计算方法如下：

式中：X——蛋白酶实际酶活力，U/g；A——样品平行试验的平均吸光度；K——吸光度常数；4——反应试剂总体积，mL；n——稀释倍数；10——反应时间，min。

2.1.2 两种蛋白酶实际酶活力 见表4。

2.2 水解液中蛋白胨含量测定标准曲线

以蛋白胨浓度为横坐标，波长540 nm 处的吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线，如图2所示。根据方程得到蛋白胨含量计算公式为：y=0.0569x×0.0034（R2=0.9992）。

2.3 四元二次通用旋转组合设计分析结果

2.3.1 数学模型的建立与显著性检验 双酶水解制备蛋白胨的四元（1/2 实施）二次通用旋转组合试验设计及结果如表5所示，方差分析见表6。

图1 L-酪氨酸标准曲线Fig.1 Standard curve of L-tyrosine

表4 两种蛋白酶的实际酶活力Table 4 Actual enzyme activity of two kinds protease

图2 蛋白胨溶液标准曲线Fig.2 Standard curve of peptone solution

表5 四元二次通用旋转组合设计方案及结果Table 5 Text scheme and results in quadratic general rotary unitized design

表6 试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of results

根据试验结果得到拟合方程的各项系数，且蛋白胨得率方程为：

Y=29.2586+1.1782X1+0.8304X2+0.9769X3+0.8305X4-1.9362X12-2.4524X22-1.6039X32-1.9203X42-3.1338X1X2-0.4488X1X3+1.9038X1X4。

对该模型进行显著性分析，结果如表6所示。该回归方程的失拟性检验F1=2.7020＜F0.05（5，3）=9.01，结果不显著，表示未知因素对试验结果干扰较小；显著性检验F2=16.3893＞F0.01（11，8）=5.74，结果极显著，表示该模型预测值与实测值拟合性良好。单因素中X2和X4不显著，X1和X3均达到显著水平，且二次项均极显著。剔除α=0.10 的不显著项得到回归方程：

Y=29.2586+1.1782X1+0.9769X3-1.9362X12-2.4524X22-1.6039X32-1.9203X42-3.1338X1X2+1.9038X1X4

最高值的各因素水平组合为：X1=1.682，X2=-1，X3=0，X4=1，即双酶配比1.84∶1，酶解 温 度50℃，酶解pH 8.0，酶解时间4 h，此时Ymax=29.86%。

2.3.2 蛋白胨得率单因素效应分析 根据试验结果分析单因素效应（其它因子为零水平），结果如表7所示。图3为各单因素与蛋白胨得率之间的关系图。

表7 单因素效应分析Table 7 Effect analysis of single factor

由表7和图3得知，蛋白胨得率随各因素水平的升高呈现先增大后减小的趋势，且影响顺序是X1＞X3＞X4＞X2，即双酶配比＞酶解pH＞酶解时间＞酶解温度。

由表6可看出，交互作用存在且达到显著水平的因素有X1X2及X1X4，仅对这两组因素的交互作用进行效应分析。选取2 个因素零水平，考察另外2 个因素的交互作用，得到图4。由图4a 可看出在酶解温度一定时，增大双酶配比可显著提高蛋白胨得率，而在双酶配比一定时，升高温度使蛋白胨得率呈先上升后平稳的趋势；图4b 表明双酶配比和酶解时间的交互作用对蛋白胨得率同样有较大影响。

2.3.3 酶解工艺优化与验证 根据分析结果，发现试验不仅有单因素效应，还有因素间的相互作用，很难仅从这两项分析中确定最优酶解条件，而且四元二次回归数学模型无法确定蛋白胨得率的极大值。本试验综合采用频率法分析该回归模型[15]，确定最佳酶解条件。表8为蛋白胨得率大于23.86%的121 个方案中各变量取值的频率分布。

图3 各单因素与蛋白胨得率的关系Fig.3 Relationship of single factors and yield of peptone

由表8可知，在95%置信区间内蛋白胨得率大于23.86%的各变量取值区间分别为0.301～0.680，-0.509～-0.157，0.274～0.591，0.084～0.427，即双酶配比为1.115 ∶1～1.34 ∶1（质量比），酶解温度52.455～54.215 ℃，酶解pH8.137～8.296，酶解时间3.084～3.427 h。结合实际可行性，确定最优酶解工艺为：双酶配比1.3 ∶1、酶解温度54 ℃、酶解pH 8.2、酶解时间3.4 h，按照回归方程计算出蛋白胨得率预测值为29.83%。按此条件做验证试验，平行测定3 次，结果分别为28.66%，29.42%，29.76%，取平均值为29.28%，和预测值相近，验证了该回归模型的合理性。

图4 双酶配比与酶解温度（a）和酶解时间（b）交互作用效应Fig.4 Interaction effect of double enzyme ratio with hydrolytic temperature（a）and hydrolytic time（b）

表8 各变量取值的频率分布Table 8 Probability distribution of variables

3 结论

以脱脂鸡副产物为原料，以水解度及蛋白胨得率为考察指标，通过单因素试验分别比较胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶5 种酶在各自最适条件下的水解度及蛋白胨得率，最终确定水解效果最佳、条件差异较小的两种酶是胰蛋白酶和碱性蛋白酶，其在各自最适条件下水解度及蛋白胨得率分别为：14.49%，23.82%和14.61%，24.40%，因此选择这两种酶进行后续双酶解试验。选用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对脱脂鸡副产物混合蛋白进行复合酶解制备蛋白胨。

以蛋白胨得率为指标，通过四元二次通用旋转组合设计优化双酶水解鸡副产物制备蛋白胨工艺的数学回归模型。在本试验范围该模型可预测脱脂鸡副产物混合蛋白复合酶解制备蛋白胨的提取率。确定各因素最优水平为双酶配比1.3∶1、酶解温度54 ℃、酶解pH 8.2、酶解时间3.4 h，该条件下蛋白胨得率实测值为29.28%。