血清miR-200a、miR-190联合检测在结直肠癌诊断及预后评估中的应用价值

结直肠癌是临床上常见的消化系统肿瘤，其起病隐匿，预后不良，发病率较高[1]。早期结直肠癌患者经手术治疗后的5年生存率可达90%以上，而发生转移的患者和晚期患者的5年生存率低于15%[2]。目前临床上筛查结直肠癌的血清标志物包括癌胚抗原、糖类抗原19-9(CA19-9)等，但其敏感度和特异度均较低，且对术后复发的预测中效果并不理想[3]。因此，寻找更有效的血清标志物对于改善患者的预后具有重要意义。微RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，在动植物及病毒中均广泛存在。近年来，随着分子医学及相关检测手段的飞速发展，miRNA在各种肿瘤的发生、发展及转归中的作用已得到学者们的广泛认可[4]。研究表明，miR-200a、miR-190在肿瘤的发生、发展中起着抑癌基因的作用，其在结直肠癌组织中低表达，且与多种恶性肿瘤关系密切[5-6]。本研究通过检测miR-200a、miR-190在健康人群及结直肠癌患者中的表达水平，并比较其在术后复发患者和未复发患者中的表达差异，探讨其在结直肠癌诊断及预后评估中的价值，为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 基本资料

选择2016年1月至2018年1月期间在昌江县人民医院接受手术治疗的63例结直肠癌患者作为结直肠癌组，患者均经术后病理组织学确诊。患者均随访1年，根据复发情况分为术后复发组(16例)和术后未复发组(47例)。排除转移性结直肠癌患者，排除合并其他部位肿瘤及术前经放射治疗、化学治疗等可能影响本研究结果的患者。另选取35位同期健康体检者作为对照组。结直肠癌组中，男37例，女26例，平均年龄(63.47±8.36)岁；对照组中，男20例，女15例，平均年龄(63.15±7.92)岁。将结直肠癌组分为两个亚组：术后复发组中，男10例，女6例，平均年龄(63.57±7.84)岁；术后未复发组中，男28例，女19例，平均年龄(62.89±8.21)岁。结直肠癌组与对照组、术后复发组与未复发组的年龄、性别等基本资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经患者知情同意，并经医院医学伦理委员会核准后进行。

1.2 方法

结直肠癌组患者于术前及术后3个月清晨采集外周静脉血标本5 mL，对照组于体检当日采集外周静脉血标本5 mL。所有血清标本均采用医用离心机3 000 r/min离心15 min，取上清液置于-20℃的冰箱保存待测。miR-200a、miR-190相对表达量应用实时荧光定量PCR技术进行分析，Trizol法抽提与纯化总RNA，确保纯度符合要求，以总RNA为模板进行逆转录反应，以cDNA为模板行荧光定量PCR，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后以U6为外参基因，采用2-△△Ct表示相对表达量。荧光定量PCR试剂盒由宝生物工程(大连)有限公司提供，所有检测操作均严格按照仪器及试剂盒说明书进行。

1.3 观察指标

比较结直肠癌组与对照组的血清miR-200a、miR-190表达水平，术后复发组与未复发组的血清miR-200a、miR-190表达水平，以及其与临床病理之间的关系。应用受试者工作特征曲线(ROC)评价血清miR-200a、miR-190表达水平诊断结直肠癌及预测术后复发的效能。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组血清miR-200a、miR-190表达水平比较

与对照组相比，结直肠癌组的血清miR-200a、miR-190的相对表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组的血清miR-200a、miR-190相对表达量比较()

2.2 血清miR-200a、miR-190表达水平与结直肠癌患者临床病理参数的关系

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的结直肠癌患者的miR-200a相对表达量低于Ⅰ～Ⅱ期患者，存在淋巴结转移患者的miR-200a和miR-190的相对表达量均低于无淋巴结转移患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 血清miR-200a、miR-190相对表达量与结直肠癌患者临床病理参数的关系

2.3 血清miR-200a、miR-190表达水平诊断结直肠癌的效能分析

因变量为二分类变量，对照组标记为0，结直肠癌组标记为1，自变量为miR-200a、miR-190的相对表达量。结果显示，miR-200a、miR-190联合检测的ROC曲线下面积(AUC)明显大于单指标检测(Z=3.567，P=0.019；Z=2.396，P=0.041)，联合检测的敏感度、特异度均优于单指标检测(P<0.05)。见图1和表3。

图1 血清miR-200a、miR-190水平诊断结直肠癌的ROC曲线

表3 血清miR-200a、miR-190表达水平诊断结直肠癌的效能

注：“—”表示无数据

2.4 术后复发组与未复发组术后3个月的血清miR-200a、miR-190表达水平比较

结直肠癌患者术后随访1年，复发16例，未复发47例。复发组术后3个月的血清miR-200a、miR-190相对表达量均低于未复发组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组术后3个月的血清miR-200a、miR-190相对表达量比较()

2.5 术后3个月的血清miR-200a、miR-190水平预测结直肠癌术后复发的效能分析

因变量为二分类变量，术后未复发组标记为0，术后复发组标记为1，自变量为miR-200a、miR-190的相对表达量。结果显示，miR-200a、miR-190联合检测的AUC大于单指标检测(Z=3.146，P=0.028；Z=2.451，P=0.043)，联合检测的敏感度、特异度均优于单指标检测(P<0.05)。见图2和表5。

图2血清miR-200a、miR-190水平预测结直肠癌术后复发的ROC曲线

表5 血清miR-200a、miR-190水平预测结直肠癌术后复发的价值

注：“—”表示无数据

3 讨论

随着人们生活水平的改善以及饮食习惯的改变，结直肠癌已成为临床上常见的消化系统肿瘤，其发病率不断升高且呈年轻化趋势，每年有近50%发病患者死亡[7]。研究表明，早期结直肠癌患者预后较好，而晚期及淋巴结转移患者的预后较差[8]。因此，深入研究结直肠癌的发病机制，寻找有效的早期诊断指标，对指导临床早期诊治及预后评估具有重要意义[9]。近年来，miRNA已成为肿瘤研究的热点，其通过调控信使RNA(mRNA)降解或沉默蛋白翻译，参与细胞增殖、凋亡及肿瘤发生等生物学过程[10]。miRNA的失调涉及肿瘤发生、发展中的多个细胞进程，包括分化、增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成和上皮-间质转化(EMT)。目前已发现上千种miRNA，不同部位、类型的肿瘤具有特异的miRNA表达谱[11]。

miR-200a、miR-190可在血液、尿液及脑脊液等体液中检出，稳定性较好，可作为血清肿瘤标志物。有报道指出，miR-190可通过降低血管内皮生长因子(VEGF)表达，抑制肿瘤新生血管形成，继而抑制肿瘤生长[12]。miR-190可抑制结直肠癌细胞中的DPC4基因表达，并负向调控，起着抑癌基因的作用[13]。miR-200a是miR-200家族成员之一，其可通过调控EMT过程，对肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移发挥关键作用[14]。本研究发现，结直肠癌患者术前血清miR-200a、miR-190表达水平均低于对照组，且与TNM分期及有无淋巴结转移密切相关。提示miR-200a、miR-190可能在结直肠癌的发生、发展中发挥着至关重要的作用。O′Brien等[15]和Lin等[16]的研究发现，miR-200a、miR-190与结直肠癌的发生关系密切，其在结直肠癌的早期诊断中具有较高的参考价值。本研究结果显示，miR-200a、miR-190表达水平诊断结直肠癌的AUC分别为0.790、0.882，两者联合诊断的AUC为0.903，敏感度为86.36%，特异度为81.25%，联合诊断的敏感度和特异度较高。

目前有关miR-200a、miR-190的表达水平在预测结直肠癌术后复发中价值的研究尚不多见。有研究发现，miR-200a的高表达与结直肠癌患者较长的总生存期有关[17]。miR-190是ZEB1的转录靶标，其表达降低可导致胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)水平升高，促进肿瘤的进展，与结直肠癌患者的预后呈负相关[18]。本研究结果发现，术后3个月复发组的血清miR-200a、miR-190表达水平低于未复发组，ROC曲线分析显示miR-200a、miR-190表达水平预测结直肠癌术后复发的AUC分别为0.875、0.895，两者联合预测的AUC为0.932，敏感度为91.58%，特异度为86.33%，提示联合预测的敏感度和特异度较高。

综上所述，结直肠癌患者的血清miR-200a、miR-190表达水平降低，可作为结直肠癌早期诊断及预测术后复发的标志物，两者联合检测可提高诊断及预测的敏感度和特异度。