肝纤维化过程中肝组织中Nrf2、NOX4 mRNA表达及血清ROS水平的变化

肝纤维化是由各种急慢性肝损伤所引起的，由细胞外基质(ECM)包括胶原蛋白、透明质酸在肝组织间质的合成和降解不平衡而导致的病理改变[1]。氧化应激是影响肝纤维化进展的重要因素，其可促进肝纤维化形成，加重肝细胞坏死和凋亡[2]。氧化应激是许多肝脏疾病的发病机制，在肝脏疾病的发展中起着重要作用[3]。近年来的研究表明，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)通过产生活性氧簇(ROS)等过氧化物来介导氧化应激参与肝纤维化的进程，与肝纤维化密切相关，而NOX家族成员之一的NOX4是ROS的主要来源，其在引起肝纤维化的主要细胞肝星状细胞(HSC)中表达丰富，并通过介导多条细胞信号通路来诱导HSC活化，从而导致肝纤维化[4]。核因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞抵御氧化应激的重要的转录因子，通过调节抗氧化酶活性和下游基因表达，在四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化中起保护作用[5]。本实验采用CCl4诱导建立大鼠肝纤维化模型，观察肝纤维化形成过程中肝组织中Nrf2 mRNA、NOX4 mRNA及血清ROS水平的变化，探讨三者在肝纤维化形成过程中的作用，为临床延缓和预防肝纤维化发生、发展提供新的诊疗依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和主要试剂

选取清洁健康的雄性大鼠30只，体重为190～210 g，购自河北医科大学生理实验室。血清ROS比色法试剂盒购自江苏南京建成公司。Trizol裂解液、异丙醇、随机引物、Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂、逆转录酶、Nrf2、β-actin引物购自上海生工生物科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备及分组 将30只雄性SD大鼠随机分为两组，正常对照组6只，模型组24只。模型组大鼠每周2次给予40% CCl4油剂皮下注射，共8周，首次剂量为5 mL/kg，其后3 mL/kg。正常对照组给予相同剂量的食用油剂皮下注射。两组大鼠均给予正常饮食。在第8周杀死正常对照组大鼠6只，在2、4、6、8周分别杀死模型组大鼠6只，留取相同部位的肝组织及血清备用。

1.2.2 组织病理学检查 10%甲醛溶液浸泡固定肝左叶组织，乙醇梯度脱水，二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ透明，浸蜡包埋，切成3 μm切片，常规HE及 Masson三色染色，光学显微镜下观察。根据胶原纤维增殖和肝脏结构破坏程度，将肝纤维化分为S0～S4期：(1)S0期 无纤维化；(2)S1期 纤维化扩大但仅局限于小叶中央，未形成小叶间隔；(3)S2期 纤维化扩大，形成多条纤维间隔，但小叶结构大致保留；S3期 大量纤维间隔形成并破坏肝小叶，导致小叶结构紊乱，但无肝硬化；(4)S4期 早期肝硬化形成。

1.2.3 血清ROS水平测定 采用比色法测定血清ROS水平。

1.2.4 Real-time PCR测定肝组织中Nrf2、NOX4 mRNA水平 (1)采用TRizol试剂一步法抽提肝组织中总RNA，采用紫外线分光光度计测量RNA水平和纯度；(2)取1 μg总RNA作为反转录模板，逆转录为cDNA；(3)按照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10反应体系进行Real-time PCR过程。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min，随后依次在94 ℃环境下15 s，60 ℃环境下60 s，共45个循环，反应结束。荧光定量PCR读取每个目的基因与对照基因β-actin的CT值，并用Quantity One软件进行相对定量统计分析，以2-ΔΔCT表示mRNA的相对表达量。Real-time PCR引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 病理学检查结果

光镜下，正常对照组可见肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞无病变。在模型组早期阶段，肝细胞水肿，气球样变及部分脂肪变；随着造模时间延长，细胞脂肪变更加明显，汇管区炎性反应加重，并伴有不同程度的肝细胞坏死，肝小叶中央静脉周围及汇管区纤维沉积明显增多；第8周时，肝小叶结构紊乱，形成假小叶。2周时模型组与正常对照组肝脏胶原纤维面积百分比的差异无统计学意义(P>0.05)；而随着造模时间的延长，与正常对照组相比，模型组的肝纤维化程度逐渐加重，肝脏胶原纤维面积百分比在4、6、8周时升高(6、8周时升高更明显)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组的肝纤维化病理分期和胶原纤维面积百分比比较()

注：模型组(2周)与正常对照组比较，aP>0.05；模型组(4、6、8周)与正常对照组比较，bP<0.05

2.2 两组肝组织中Nrf2、NOX4 mRNA水平变化

2、4、6、8周时模型组肝组织中Nrf2 mRNA、NOX4 mRNA水平均较正常对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。但随着肝纤维化的形成及加重，Nrf2 mRNA水平的升高幅度较NOX4 mRNA低，6、8周时尤为明显。见表3、图1。

表3 两组肝组织中Nrf2、NOX4mRNA水平比较()

注：各时期模型组与正常对照组相比，aP<0.05

2.3 两组血清ROS水平变化

随着造模时间的延长，模型组肝纤维化逐渐形成和发展，血清ROS水平整体呈升高趋势，6周时达到最高，8周时有所下降，且模型组2、4、6、8周时血清ROS水平均较正常对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

图1 两组肝组织中Nrf2、NOX4 mRNA水平变化

表4肝纤维化形成过程中血清ROS的变化

组别数量/只ROS/μg·mL-1正常对照组61.56±0.84模型组2周61.84±0.69a模型组4周61.72±0.65a模型组6周62.48±1.14a模型组8周61.82±0.46a

注：各时期模型组与正常对照组相比，aP<0.05

2.4 相关性分析

将Nrf2、NOX4与ROS进行Pearson相关分析，结果显示Nrf2与ROS、Nrf2与NOX4、NOX4与ROS三组之间均存在正相关性(r=0.862，P=0.000；r=0.091，P=0.001；r=0.315；P=0.000)。

3 讨论

肝纤维化是ECM过度沉积引起的慢性肝脏病理改变，是肝硬化和肝细胞癌发生的必经途径，其发生涉及各种机制，如局部肾素-血管紧张素系统(RAS)激活、基质金属蛋白酶表达失衡和自噬等。近年来的研究表明，NOX活化诱导的ROS介导的氧化应激与肝纤维化形成密切相关。NOX家族主要由NOX1、NOX2、NOX3、NOX4等多种亚基组成，其中NOX4是纤维化发生过程中ROS的主要来源[6]。NOX4通过产生ROS，分别介导了血小板生成素、转化生长因子-β(TGF-β)等促纤维化因子作用下的细胞活化[7]。TGF-β是肝纤维化形成的重要调节因子，可通过TGF-β/Smad-3信号转导通路诱导NOX4，介导HSC的活化，刺激胶原蛋白的合成和沉积。研究表明，NOX4的促纤维化反应是由TGF-β介导的，它在TGF-β诱导的纤维化反应中具有促进胶原产生等重要作用[8]。以往研究表明TGF-β激活HSC的过程依赖NOX的激活及ROS的产生，产生的ROS刺激PI3K/Akt途径是肝纤维化形成的关键。此外，使用NOX4抑制剂GKT137831可有效减少CCl4或胆管结扎诱导的大鼠ROS的产生和肝纤维化[9-10]。上述结果都说明NOX4激活产生ROS介导的氧化应激与肝纤维化的形成密切相关。本实验以CCl4诱导建立大鼠肝纤维化模型，发现随着肝纤维化的形成，肝组织中NOX4 mRNA及血清ROS水平呈升高趋势，但8周时模型组血清ROS水平有所下降，这可能是由于随着肝损伤的加重，机体无法清除大量的ROS，导致其明显升高，而在肝纤维化后期，众多促肝纤维化激活因子活化，使ROS的促纤维化作用弱化，表达水平下降。该结果表明ROS在肝纤维化形成中起着重要作用。研究表明阻断PI3K活化可抑制HSC增殖和胶原蛋白沉积，从而抑制肝纤维化形成[8]，这与本次实验结果相符，也证实了ROS的促纤维化作用。进一步行相关性分析发现，NOX4 mRNA与ROS水平呈正相关。这一结论不仅证实了NOX4的促纤维化作用，而且其促纤维化作用可能是通过产生ROS来介导氧化应激实现的。以往研究显示氧化应激可促进HSC激活以及增加胶原合成。

Nrf2作为体内抗氧化反应的重要转录因子，其与肝脏疾病的关系也日益受到重视[11-12]。生理状态下Nrf2与其细胞质锚连分子Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP1)结合而被泛素依赖性蛋白酶系统降解，仅残留少部分用于维持还原型谷胱甘肽(GSH)等的基础表达。氧化应激时KEAP1发生磷酸化变构，与Nrf2解离。自由态的Nrf2进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)结合，Nrf2/ARE通路被激活后，启动下游的谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶，清除氧化应激过程中过多的ROS，增强机体的抗氧化能力[13]。TGF-β是肝纤维化形成的关键因子，可通过Smad-3的激活而下调GST、GCLC、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的表达，而Nrf2能通过调节氧化还原敏感的转录激活蛋白和核因子-κB (NF-κB)，下调TGF-β。GST、GCLC、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶均为Nrf2的下游基因，由此可见Nrf2与肝纤维的形成密切相关。因此，本研究以CCl4诱导建立大鼠肝纤维化模型，观察肝纤维化形成过程中Nrf2的表达，发现随着肝纤维化的进展，大鼠肝组织中Nrf2的表达呈升高趋势，将Nrf2与NOX4的变化结合起来观察，发现随着肝纤维化的进展，两者的表达均呈升高趋势，并且相关性分析显示两者的表达呈正相关，但Nrf2的表达升高幅度较NOX4低，在6、8周时尤为明显，说明随着肝纤维化的形成和发展，Nrf2无法拮抗NOX4，从而使其促进了肝纤维化的形成和发展，此结论不仅证实了NOX4的促纤维化效应以及Nrf2的抗纤维化作用，也说明了NOX4、Nrf2在肝纤维化形成阶段可能发挥着重要作用。研究发现给予Nrf2激活剂，可减慢由胆道结扎引起的小鼠肝纤维化的进展及降低促纤维化基因的表达。此外，与正常小鼠相比，Nrf2缺陷鼠对CCl4诱导的肝损伤修复显著延迟，肝纤维化程度及炎性反应明显加重，这是由于肝细胞的Nrf2及其编码的酶减少，对CCl4及其代谢产物的解毒作用减弱有关[14]。这与本实验结果相符，也证实了Nrf2的抗纤维化效应。

本研究通过观察Nrf2、NOX4的表达与血清ROS水平的动态变化，证实了NOX4、ROS的促纤维化作用，以及Nrf2的抗纤维化作用。此外，本研究还发现Nrf2、NOX4、ROS呈正相关，说明可能存在NOX4通过产生ROS介导的促纤维化因子影响Nrf2表达。由此可见，Nrf2可能成为肝纤维化治疗的一个新靶点。