丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的克隆表达和免疫原性分析

张靖鹏 江锦秀 林裕胜 游伟 胡奇林

摘要：【目的】构建表达丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的重组表达菌，为Mmc-3740蛋白的进一步研究与应用奠定基础。【方法】采用PcR技术从Mnlc-47中扩增出该基因，进行克隆、测序，将克隆质粒与pET-28a分别双酶切，回收正确的片段进行连接构建重组表达质粒，转化至表达菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，产物用sDs-PAGE检测，用镍柱对其纯化后免疫小鼠获得高免血清，并进行Westenl-blot验证。【结果】成功构建了克隆和表达载体，重组菌表达目的蛋白大小约21ku。表达产物通过镍柱纯化后可得到单一的目的蛋白条带，westem-blol检测结果显示所表达的目的蛋白有较好的免疫原性。【结论】成功在BL2l（DE3）宿主菌内表达了Mnlc-3740重组蛋白。

关键词：丝状支原体山羊亚种;特异基因;原核表达;免疫原性

中图分类号：S852.62文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）10-1124-05

0引言

【研究意义】丝状支原体山羊亚种Mycoplasmamycoides subsp.capri，Mille是引起羊支原体性肺炎（Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPGS）的重要病原之一，此外，还可引起山羊的乳房炎、败血病、角膜结膜炎等。MPGS以羊持续流鼻液、渐进性消瘦为主要临床症状，剖检以肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎、肺部有明显的肝变H为主要特征，传染性强，发病率约50%，致死率约为40%，给国内外养羊业造成严重的经济损失。Mmc屬丝状支原体簇（mycoplasmamycoides cluster，Mm cluster），丝状支原体簇是柔膜体纲支原体目支原体科支原体属下一群遗传上和血清学关系相近的支原体，包含6个重要的反刍兽病原支原体，其中与小反刍兽有关的支原体除MmC以外还有山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasmacapricolum subsp.capripneumoniae，Mccp）及山羊支原体山羊亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capri-colum，Mcc），它们的基因组同源性很高，理化特性相似，血清学上存在交叉反应，不易通过血清学方法进行准确鉴定。因此，对Mille特异蛋白的研究对Mmc血清学检测方法的建立有重要的意义。【前人研究进展】Thiaucourt F对Mmc 95010（登录号：FQ377874.1）株进行全基因组测序，分析发现其基因组大小约1153998bp，包含922个开放阅读框架和一个1840bp的质粒，但到目前为止，有关Mmc特异性蛋白的研究报道较少，主要免疫相关蛋白也尚未明确。课题组前期应用生物信息学软件分析发现Mmc-3740基因为Mmc特有的基因，长度为435bp，编码144个氨基酸，通过生物信息学软件预测其为免疫原性良好的分泌型蛋白。【本研究切入点】关于Mmc-3740基因功能的研究尚未见开展，因此通过原核表达并验证该蛋白的特异性和免疫原性，对其后续的研究与应用具有十分重要的意义。【拟解决的关键问题】本研究通过对Mmc-3740基因表达及其表达产物的初步鉴定，为进一步研究该基因的生物学与免疫学功能奠定基础，同时促进Mmc相关诊断方法的研究开发。

1材料与方法

1.1材料

Mmc菌株Mmc-45、Mmc-47由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存。

普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、E.coli DH5a、限制性内切酶BamHI、HindlII，pMD-19T和T4DNA连接酶购自大连宝日医生物;HRP标记的羊抗鼠IgG购自Proteintech公司;基因组提取试剂盒、蛋白质纯化试剂盒和Ni-NTAHis.Bind Resin购自北京全式金生物有限公司;SDS.PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒、BSA封闭液、LB培养基、IPTG、卡那霉素、氨苄青霉素等购自上海生工生物，表达菌BL21（DE3）、表达质粒pET-28a由本实验室保存。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成

根据Mmc-3740基因序列，利用Primer 6.0设计引物FM-37401、RM-37401。上游引物FM-374015'-GGATCCGTGATAAAGTTATTGACTTTATTAG-3’，引入酶切位点BamHI，下游引物RM-374015’-AAGCTTTTATTGTACTGTATTGTGTTCTTC-3’，引入酶切位点HindlII，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2基因的提取与目的基因的扩增、测序利用组织/细菌DNA提取试剂盒提取Mmc-47基因组DNA，用于扩增Mmc-3740基因。PCR扩增体系为50ul：Mmc基因组DNA3ul，上、下游引物（10umol-L）各1ul，TaqDNA聚合酶25ul，去离子水20ul;扩增条件为：95°C预变性5min，95°C变性30s，50%退火20s，72°C延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带用胶回收试剂盒进行回收，将其与pMD-19T载体连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，利用质粒小提试剂盒提取质粒做PCR鉴定和酶切鉴定后，送上海生工进行测序。

1.2.3重组表达质粒的构建将测序正确的重组pMD-19T质粒，与pET-28a质粒分别双酶切，酶切体系为：BamHI 1ul，HindlII 1ul，10XBuffer 2ul，16ul 的pMD-19T与pET-28a，总体积20ul，37°C酶切2h。分别回收目的片段与pET-28a的质粒片段，于16°C连接过夜，连接体系：T4DNA连接酶1ul，Buffer 2ul，目的基因6ul，pET-28a载体1ul。将连接产物转化BL21（DE3）感受态细胞。利用蓝白斑筛选阳性克隆并提取质粒，送上海生工进行测序，将重组质粒命名为DET-28a-3740。

1.2.4重组Mmc-3740蛋白的诱导表达 将鉴定为阳性的重组菌接种于含100ug.mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C，200r·min振荡培养至OD值达到0.6，加入IPTG，并使其终浓度为1mmlo.L，37°C、200r.min诱导培养6h。

1.2.5表达产物的鉴定与纯化将10mL诱导培养的重组菌离心，以2mL pH7.8的PBS重悬，超声破碎，离心后吸取上清，并向沉淀中加2mLPBS重悬，各取15ul的上清与沉淀分别与5ul4×Proteinloading buffer混合，煮沸10min后上样进行SDS.PAGE。将超声破碎后的沉淀用0.45pan的滤器过滤后，用上海生工的镍离子层析柱对表达蛋白进行纯化。

1.2.6Western blotting验证用纯化的表达蛋白免疫小鼠，每只60ul，共免疫3次，第一次以弗氏完全佐剂免疫，后两次以弗氏不完全佐剂免疫，每次相隔14d，以制备小鼠高免血清。表达蛋白经过SDS.PAGE后，利用电转仪将蛋白转到PVDF膜上，BSA封闭液4°C封闭过夜，以1：2000稀释的小鼠高免血清作为一抗37°C孵育1h，PBST洗涤，1：10000稀释的羊抗鼠IgG 37℃孵育1h，PBST洗涤，利用4-CN显色法，对结果进行判定。

2结果与分析

2.1Mmc-3740基因的擴增与鉴定

以Mmc-47株基因组为模板，进行PCR扩增后，得到与目的条带大小相符的基因片段，约435bp（图1）。对其进行TA克隆后构建的pMD.19T载体测序后与NCBI上公布的Mmc 95010株进行比对，相似性为94.2%，与本研究室保存的Mmc-45株相比，相似性为98.4%，均为点突变，翻译为氨基酸序列后进行比对，其氨基酸序列相似性为100%。

2.2重组质粒PET-28a-3740的构建

将含有Mmc-3740基因的重组pMD-19T质粒与表达载体pET-28a分别双酶切，回收目的片段，经T4DNA连接酶连接后，构建重组表达质粒pET-28a-3740，转化BL21（DE3），扩大培养，提取质粒，分别进行酶切和测序验证，双酶切结果如图2所示。

2.3诱导表达

重组菌在37℃培养至OD值0.6时加入IPTG，在IPTG诱导下，经SDS-PAGE分析得到目的条带约21ku（图3），以不含目的基因的空载体加IPTG诱导，相同条件下在BL21（DE3）中不表达目的蛋白。

2.4表达蛋白的纯化与鉴定

利用超声法破碎IPTG诱导后的重组表达菌液，收集上清与沉淀进行镍柱纯化，最后的洗脱液经SDS-PAGE分析，在21ku处可见一条单一的条带，得到纯化的目的蛋白（图4）。以纯化的蛋白免疫小鼠，采集血清作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，通过Western-blot验证的结果证明该蛋白具有良好的免疫原性。

3讨论与结论

羊支原体性肺炎（MPGS）在山羊和绵羊中广泛流行，是一种危害严重的疾病，Mille为MPGS的重要病原之一，其仅仅感染山羊，大量研究表明，目前Mmc在中国多个省份的山羊养殖场中流行，给山羊养殖业带来重大的经济损失。

支原体是一类缺乏细胞壁的原核微生物，对营养要求非常苛刻，需要在特殊培养基中才能生长，且生长缓慢，常需要培养3-7d，因此传统的病原分离培养鉴定Mmc费时费力。丝状支原体簇成员之间很高的同源性使得用传统的血清学方法无法对其进行区分。目前对于Mmc特异性抗原的报道还比较少，已报道的特异性抗原基因有LPPA基因和由10个ORF串联而成的麦芽糊精/麦芽糖（maltodextrin/maltose）基因，张玲等表达了LPPA融合基因，并验证其有良好的免疫原性和反应性，但未见其应用于检测方法研究的报道。储岳峰等利用MmcPG3株经超声波破碎处理后的产物致敏经戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞，建立了检测Mmc抗体的间接血凝试验方法，该方法可将Mmc与绵羊肺炎支原体和布鲁氏杆菌区分，但对同源性更为相近的丝状支原体簇成员的血清学检测方法尚未见报道。

本研究基于对Mmc-3740基因的分析，成功构建了pET-28a-3740重组表达质粒，将其转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，通过优化条件，使其在大肠杆菌中获得大量表达，表达的融合蛋白大小约为21ku，不同浓度的分离胶的最佳分离范围不同，根据预测的重组蛋白的大小，本试验选用的分离胶浓度为12%，浓缩胶为5%，分离效果良好。将菌体超声破碎离心后进行SDS-PAGE电泳分析，在沉淀与上清液中都含有目的蛋白条带，主要为包涵体表达且有较高的表达量。本试验主要用镍离子螯合柱对pET-28a表达的带有组氨酸标签的重组蛋白进行可逆性的亲和结合而使重组蛋白达到分离纯化;将纯化后重组蛋白免疫小鼠制备重组Mmc-3740蛋白阳性血清，通过Western-blot验证发现二者间可以发生反应，证明Mmc-3740基因所表达的蛋白具有良好的免疫原性，与之前抗原性预测的结果一致。本研究在BL21（DE3）宿主菌内成功表达了Mmc-3740重组蛋白，为进一步研究Mmc-3740蛋白的功能特性奠定了基础，也为研究和筛选新的Mmc特异性蛋白提供了参考。