基于超高效液相色谱法和色差仪法的黄芩药材质量评价

袁杰 李锬 周利 蒋待泉 梁玖雯 杜用玺 曾燕 王升 郭兰萍

摘要 目的：通过对不同黄芩药材的化合物含量和色度的测定，评价药材质量。方法：采用超高效液相色谱法（UPLC）测定黄芩化合物含量，同时采用色差仪法测定药材色度。结果：不同产地和等级黄芩的黄芩苷含量存在一定的差异，并且黄芩粉末颜色与其等级有较明显关系。结论：超高效液相色谱法和色差仪法可为评价黄芩药材质量提供参考。

关键词 黄芩;超高效液相色谱;色差仪法;质量评价

Quality Evaluation of Scutellaria baicalensis Georgi Based on UPLC and Colorimetry

Yuan Jie1，2，Li Tan1，Zhou Li1，Jiang Daiquan1，Liang Jiuwen1，Du Yongxi1，Zeng Yan3，Wang Sheng1，Guo Lanping1

（1 State Key Laboratory of Dao-di Herbs Breeding Base，National Resource Center for Chinese Meteria Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 3 China National Traditional Chinese Medicine Co.， Ltd.， Beijing 100195，China）

Abstract Objective：To evaluate the quality of Scutellaria baicalensis Georgi by determining the content of different bathes and its colorimetry compounds.Methods：Ultra performance liquid chromatography（UPLC）was used to determine the contents of Scutellaria baicalensis Georgi and the chromaticity of Scutellaria baicalensis Georgi was determined by colorimetry.Results：The content of baicalin in Scutellaria baicalensis Georgi from different areas and grades were different，and the chromaticity of Scutellaria baicalensis Georgi powder was obviously related to its grades.Conclusion：The method of UPLC and Colorimetry can provide reference for evaluating the quality of Scutellaria baicalensis Georgi.

Key Words Scutellaria baicalensis Georgi; UPLC; Colorimetry; Quality evaluation

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.006

黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi），为唇形科黄芩属植物黄芩的干燥根，主要分布在山西、河北、河南、内蒙古等地，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效，常应用于治疗暑湿、胸闷呕恶、黄疸泻痢、肺热咳嗽、臃肿疮毒、胎动不安等。现代研究显示，黄芩中含有黄酮类、氨基酸类、有机酸类等多种活性成分，其中主要以黄芩苷为主[1-5]。

近年来，随着黄芩新的药效作用的不断发现，市场对其需求量不断增大，当前，黄芩的种植范围逐步扩大，但是由于环境或是技术的限制，其质量参差不齐，直接影响到与黄芩有关的中药产品疗效[6-8]。因此，采用一些手段对不同来源黄芩的质量进行评价显得尤为重要。许多研究都认为优质黄芩外观具有根条粗长、体质坚实、内色鲜黄的特征，2018年由中华中医药学会发布的《中药材商品规格等级》中将黄芩分为栽培和野生2个规格，其中一等选货栽培黄芩：直径≥1.5 cm，长度≥10 cm;二等选货栽培黄芩：直径范围1.0～1.5 cm，长度≥10 cm;三等选货栽培黄芩：直径范围0.7～1.0 cm，长度范围5～10 cm;选货黄芩为除去一等、二等、三等以外的选货栽培黄芩;统货黄芩为不分大小的栽培黄芩;野生统货黄芩为枯芩，表面粗糙，棕黄色或深黄色，中心枯朽状或已成空洞，气微、味苦[9-11]。

基于此，本研究认为可根据黄芩的性状并结合其有效成分的含量作为评价黄芩质量优劣的依据，即采用分光測色仪[12]和超高效液相色谱（UPLC）[13-14]分别检测不同产地和等级黄芩色度以及7种黄酮类化合物含量，以期评价不同产区和等级黄芩药材质量，同时为建立高品质黄芩药材道地产区提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ACQUITY UPLCTM I-CLASS系统（Waters公司，美国，型号UPLC I-class）;SB-800 DTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号SB-800-DTD）;New Classic MS-S电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司，型号XS105）;Eppendorf 5810R离心机（Eppendorf公司，德国，型号5810R）;CM-700D便携式分光测色仪（也称色差仪）（Konica Minolta，日本，型号CM-700D）。

1.2 试药 于上海源叶生物科技有限公司购买黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品、野黃芩苷对照品、千层纸素对照品，批号分别为P20A9F59353、R27M10F89336、C04D8Y49741、W30M10Z84622、Z01M10X81701、Y31M9H62597。于中国食品药品检定研究院购买芹菜素对照品，批号为111901-201102。于美国默克公司购买色谱纯甲醇，批号为I1003307913。于赛默飞世尔科技（中国）有限公司购买甲酸试剂，批号为186260。实验室自制蒸馏水。

1.3 分析样品 河北、内蒙古、山西、山东、陕西，5个省区21个产地（县/市）药材收购商/合作社样本48份样品。见表1。

2 方法与结果

2.1 色度检测方法 取不同产地和等级的黄芩粉末样品（过2号筛），平铺于粉末测试盒内，用色差仪的测试口对准粉末测试盒，测定粉末的颜色，随机扫描10次，取平均值。

2.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流动相A：0.2%甲酸水，流动相B：甲醇;流速：0.3 mL/min;进样量：1 μL;柱温：40 ℃;检测波长：254 nm;梯度洗脱：0～5 min，流动相B 20%→31%;5～6 min，流动相B 31%→32%;6～8 min，流动相B 32%→32.5%;8～9 min，流动相B 32.5%→37%;9～10 min，流动相B 37%→40%;10～17.5 min，流动相B 40%→44%;17.5～18 min，流动相B 44%→45%;18～18.5 min，流动相B 45%→50%;18.5～22.5 min，流动相B 50%→63%;22.5～26 min，流动相B 63%→80%;26～27 min，流动相B 80%→20%;27～29.5 min，流动相B 20%→20%。在这个色谱条件下获得黄芩样品UPLC图谱和混合对照品UPLC图谱。见图1、图2。

2.3 对照品溶液的配制 精密称取野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素对照品适量，分别用甲醇配成浓度为1 mg/mL的单一成分对照品贮备液。分别精密量取上述单一对照品贮备液适量，用甲醇稀释成含有野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的配制 精密称取样品细粉15 mg，置于2 mL离心管中，精密加入70%甲醇1.5 mL，95%功率超声提取30 min，转速9 746 r/min离心10 min后，上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，将续滤液稀释10倍即得供试品溶液。

2.5 线性关系考察 将各个对照品储备液稀释成不少于5个不同质量浓度的对照品溶液，按2.2项下条件测定峰面积。以色谱峰峰面积Y为纵坐标，进样浓度X（μg/mL）为横坐标得到回归方程、线性范围与相关系数。见表2。

2.6 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，连续重复进样6次，测得野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素的峰面积的RSD分别为1.67%、1.55%、1.82%、1.60%、1.19%、1.12%、1.24%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一份药材供试品溶液分别在放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h后进样测定，测得野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素的峰面积的RSD分别为2.48%、2.25%、1.05%、2.40%、2.88%、2.92%、2.55%，表明各目标成分在48 h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一样品6份，按2.4项下方法制备供试品溶液，测得野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素的峰面积的RSD分别为2.98%、2.80%、2.43%、2.68%、1.99%、2.89%、2.80%，表明该实验方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取同一批黄芩样品6份，分为3组，分别加入适量的高、中、低浓度混合对照品溶液，分别测定各目标成分的含量，考察各目标成分的回收率。各目标成分野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素的平均加样回收率分别为98.13%、95.95%、102.85%、103.36%、104.02%、103.61%、99.75%，其RSD分别为2.70%、0.69%、1.31%、0.88%、0.72%、1.06%、1.15%。

2.10 样品测定结果

2.10.1 黄芩样品色度结果 48批不同产地和等级黄芩样品色度检测后对测定结果进行频率分布直方图以及相关性分析，结果见图3-a、图3-b、图3-c、表3及表4。

L*为亮度值，L*越大，亮度越高。由图3-a可知L*值呈较明显正态分布曲线，在（31.48～33.15）处分布最多。其中亮度值最大的黄芩为10号样品，亮度值为39.85，来源于内蒙赤峰，亮度值最小的黄芩为27号样品，亮度值为23.11，来自于山东莱芜蒙阴县。因此可认为当我们从一批黄芩样品中随机抽取一个黄芩，该黄芩的L*值有较大概率处于（31.48～33.15）。

a*为红绿色轴，a*值越大越红，越小则越绿。由图3-b可知a*值较大部分分布在（1.56～3.71），其中可认为河北产地的黄芩粉末在a*值上普遍偏低。而山西的黄芩粉末在a*值一直处于中等偏上的水平。其中a*值最大的黄芩为陕西渭南的选货黄芩，a*值为5，a*值最小的黄芩样品为内蒙赤峰的二等黄芩，a*值为0.7。

b*为黄-蓝色轴，b*值越大越黄，越小则越蓝。由图3-c可知较多的黄芩粉末处于（19.66，20.89），且当b*值在29.53以上时，就无黄芩粉末出现该值以上范围。其中b*值最大的黄芩样品为山东济南的二等黄芩，b*值为29.53，b*值最小的黄芩样品为山东莱芜蒙阴县的选货黄芩，b*值为17.19。

由表3来看L*值于a*值呈现极显著负相关，而L*值和b*值呈现极显著正相关，且a*值于b*值呈极显著负相关，即黄芩粉末亮度越高，粉末颜色越黄。由表4来看，a*值和黄芩等级呈现极显著正相关，b*值和黄芩等级数值呈现显著负相关关系，即可初步认为黄芩的大小与直径和其粉末颜色有较明显关系，也就是说该粉末如果越黄，越偏向红色，则可认为该黄芩等级较高，而如果该黄芩颜色偏绿，较倾向于蓝色，则可认为该黄芩等级较低。

2.10.2 黄芩样品化合物含量结果 48批黄芩样品黄酮类化合物检测后对测定结果进行分析，结果见图4、图5及图6。经检测黄芩中野黄芩苷含量范围为0.665 0～2.609 0 mg/g，平均含量为1.603 7 mg/g;黄芩苷含量范围为89.527 8～156.381 1 mg/g，平均含量为121.901 7 mg/g;汉黄芩苷含量范围为18.876 9～37.591 6 mg/g，平均含量为28.804 0 mg/g;芹菜素含量范围为0.569 7～0.861 1 mg/g，平均含量为0.715 1 mg/g;黄芩素含量范围为2.976 8～31.213 7 mg/g，平均含量为10.597 9 mg/g;汉黄芩素含量范围为0.439 2～7.004 1 mg/g，平均含量为2.539 6 mg/g;千层纸素含量范围为0.213 9～3.609 1 mg/g，平均含量为1.223 7 mg/g。

图4可知测定的这些化合物中黄芩苷含量最高，芹菜素不易检出且含量较低。从图5中可知，山东的黄芩中黄芩苷平均含量相对最高，达到135.740 8 mg/g。从图6中可知，所有黄芩的黄芩苷含量普遍较高，均符合药典对黄芩苷含量的规定，其中三等黄芩的黄芩苷含量最高，枯芩中黄芩苷含量最低。

接着对黄芩中黄酮类化合物与色度进行相关性分析。见表5。从表5中可知野黄芩苷含量与汉黄芩苷含量存在极显著正相关，黄芩苷含量与汉黄芩苷含量存在极显著正相关，黄芩苷含量和汉黄芩苷含量与黄芩素含量、汉黄芩素含量和千层纸素含量存在极显著负相关，黄芩素含量与汉黄芩素和千层纸素含量存在极显著正相关，汉黄芩素含量与千层纸素含量存在极显著正相关。有意思的是，野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷代表的是糖苷类化合物，而黄芩素、汉黄芩素、千层纸素代表的是一类苷元类化合物，这2类化合物在黄芩样品中以相反的形式增加或减少，推测可能存在着2类化合物的相互转化。

除此以外，在表5中，黄芩苷和汉黄芩苷含量与a*值存在极显著负相关，并且与b*值存在极显著正相关;汉黄芩苷含量与L*值存在极显著正相关;黄芩素、汉黄芩素、千层纸素含量与a*值存在极显著正相关，并且与L*值和b*值存在极显著负相关。表明当a*值一样，粉末越黄时或是当b*值一样，粉末越倾向于绿时，黄芩中主要黄酮类化合物黄芩苷含量越高，即含有糖苷的黄酮类化合物含量越高，不含糖苷的黄酮类化合物含量越低。

3 讨论

本研究建立了UPLC方法测定中药黄芩中7种黄酮类化合物含量的方法，由实验结果可知，虽然不同产地不同等级的黄芩药材中黄芩苷含量存在着一定的差异，但是这些黄芩药材中黄芩苷含量均符合药典规定，特别是山东地区高等级黄芩的黄芩苷含量较高，表明可能是气候特征、土壤、光照强度、种植技术等因素的差异。

同时黄芩药材中各成分含量存在着一定的相关性，表明中药功效并不是由单一成分决定的，而是由多种成分共同相互作用的[15]。而且结合黄芩粉末色度进行相关性分析发现，黄芩粉末外观越黄，其主要有效成分黄芩苷含量越高，因此UPLC法和色差仪法可作为我们评价黄芩药材质量的有效方式。

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（2019-10-15收稿 责任编辑：王明）

基金项目：国家自然科学基金项目（81891014，81703648）;国家重点研发计划项目（2017YFC1700701，2017YFC1701405）;中国中医科学院重点领域（ZZ10-027）;财政部中央本级专项（2060302）;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目（ZZ13-YQ-084）作者简介：袁杰（1995.10—），男，硕士研究生，研究方向：中药资源，E-mail：1458251186@qq.com通信作者：王升（1988.04—），女，博士，助理研究员，研究方向：中药资源，E-mail：mmcniu@163.com;郭兰萍（1969.08—），女，博士，研究员，研究方向：中药资源，E-mail：glp01@126.com