刺五加调控p38MAPK信号通路对顺铂所致小鼠耳毒性的防护作用

胡文良 孙学威 郑艳秋

摘要 目的：探討刺五加对顺铂所致小鼠耳毒性的防护作用及对p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号通路的调控作用。方法：将BALB/c小鼠根据随机数字表法随机分为空白组、模型组和实验组，每组15只。除空白组小鼠外，其余3组小鼠均腹腔注射顺铂4 mg/kg，同时实验组预先给予腹腔注射刺五加4 mL/kg，空白组给予等量生理盐水干预，3组小鼠干预5 d后进行指标的检测及评价。检测3组小鼠听性脑干反应（ABR）阈值及耳蜗组织细胞凋亡情况，蛋白免疫印迹法检测3组小鼠耳蜗组织细胞p38MAPK信号通路相关蛋白表达情况。结果：与空白组比较，模型组8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR阈移升高，差异有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，实验组ABR阈移降低，差异有统计学意义（P<0.05）。空白组、模型组和实验组小鼠螺旋神经节细胞凋亡指数（AI）分别为（2.33±0.54），（19.76±0.84），（6.97±0.77），蛋白免疫印迹法检测显示，空白组、模型组及实验组螺旋神经节p-p38MAPK蛋白相对表达分别为（0.22±0.03）、（0.93±0.02）、（0.64±0.04）;磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）相对表达分别为（0.19±0.04）、（0.84±0.05）、（0.43±0.02），与模型组比较，空白组和实验组AI及螺旋神经节p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05）。结论：刺五加可对顺铂所致小鼠耳毒性起到保护作用，其机制与调控p38MAPK信号通路蛋白表达抑制耳蜗细胞凋亡程序的发生有关。

关键词 刺五加;耳毒性;顺铂;p38MAPK信号通路;细胞凋亡

Protective Effects of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi on Cisplatin-Induced Ototoxicity in Mice by Regulating p38MAPK Signaling Pathway

Hu Wenliang，Sun Xuewei，Zheng Yanqiu

Abstract Objective：To investigate the protective effect of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi on cisplatin-induced ototoxicity in mice and the regulation of p38MAPK signaling pathway.Methods：According to body mass stratification，BALB/c mice were divided into a blank group，a model group and an experimental group，with 15 mice in each group.In addition to the blank group，all the mice in the other groups were intraperitoneally injected with DDP 4 mg/kg，while the experimental group was given the same amount of saline in advance by intraabdominal injection of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi 4 mL/kg.The indexes were detected and evaluated after 5 days of intervention in each group.The threshold of auditory brainstem response（ABR）and apoptosis of cochlear tissue cells were detected.The expression of p38MAPK signal pathway-related protein in cochlear tissue cells was detected by Western blot.Results：Compared with the blank group，the ABR threshold shift in the model group increased at 8 Hz，12 Hz and 24 Hz（P<0.05），and compared with model group，ABR threshold in the experimental group decreased（P<0.05）.The AI of spiral ganglion cells in the blank group，the model group and the experimental group were（2.33±0.54），（19.76±0.84），（6.97±0.77），respectively.WB detection showed that the relative expression of p-p38MAPK protein in spiral ganglion cells in the blank group，the model group and the experimental group were（0.22±0.03），（0.93±0.02），（0.64±0.04），and the relative expression of p-CREB protein was（0.19±0.04），（0.84±0.05），（0.43±0.02），respectively.Compared with the model group，the expression levels of AI and p-p38MAPK，p-CREB in the spiral ganglion of the blank group and the experimental group were significantly different（P<0.05）.Conclusion：Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi has protective effect on cisplatin-induced ototoxicity in mice.Its mechanism is related to regulating the expression of p38MAPK signaling pathway and inhibiting the apoptotic process of cochlear cells.

Key Words Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi; Ototoxicity; Cisplatin; p38MAPK signaling pathway; Apoptosis

中图分类号：R283文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.017

顺铂（Cisplatin）化学名称为二氯二氨合铂，是目前国内外公认的具有广谱抗癌作用的一线药物，其是以二价铂为中心的一种重金属络合物，与多种抗肿瘤药物相协同且无交叉耐药性，广泛用于临床多种实体肿瘤的治疗，如头颈癌、肺癌和卵巢癌等[1-2]。然而临床不容忽视的一个问题是顺铂耳毒性不良反应较为严重，可导致双侧耳不可逆性听力丧失[3]，且目前相关作用机制尚不明确。刺五加又名五加参，是五加科植物刺五加的根或茎，性温、味辛、微苦、归脾、肾、心经;主要应用于冠心病心绞痛、脑出血、高脂血症、眩晕症、慢性气管炎及围绝经期综合征等多种疾病的临床治疗[4-5]。因此，尝试采用刺五加治疗顺铂所致小鼠耳毒性，并初步观察其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康清洁级BALB/c小鼠，8周龄，体质量20～25 g;购于中国医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（辽）2018-0008。小鼠均分笼饲养，普通饲料喂养，自由饮水，动物房温度18～25 ℃，湿度50%～75%，12 h交替光照。

1.1.2 药物 刺五加注射液（黑龙江金九药业股份有限公司，国药准字Z23020808）;顺铂（南京制药有限公司，国药准字H20080177，批号：20131004）。

1.1.3 试剂与仪器 磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）抗体（美国Santa Cruz公司）等;CKX-31荧光倒置相差显微镜，日本Olympus公司;FZ-10002电子天平，上海凡展衡器有限公司;TDZ4-WS/TDZ4WS台式低速自动平衡离心机，湖南湘仪离心机厂;PAC1000型蛋白电泳及转印系统，美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将BALB/c小鼠根据随机数字表法随机分为空白组、模型组和实验组，每组15只。除空白组小鼠外，其余3组小鼠均腹腔注射顺铂4 mg/kg，1次/d，连续注射5 d。

1.2.2 给药方法 实验组小鼠在腹腔注射顺铂前30 min预先给予腹腔注射刺五加4 mL/kg，空白组给予等量生理盐水干预，3组小鼠干预5 d后进行指标的检测及评价。

1.2.3 检测指标与方法 1）3组小鼠听性脑干反应（ABR）阈值的检测：将3组小鼠腹腔麻醉后，参考相关文献[6]进行ABR阈值的检测，刺激声为疏密相交替的次/秒的短声，测试强度从95 dB nHL开始，5 dB为1档逐级下降进行测试，ABR阈值判定以刚有Ⅰ波为准，同一刺激频率下给药前后的反应阈差值记为ABR阈移。2）3组小鼠耳蜗组织细胞凋亡情况：断头处死3组小鼠，暴露耳蜗，小心将蜗内组织及蜗轴取出，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，并制备石蜡切片，切片常规脱蜡至水，加入蛋白酶K工作液37 ℃反应30 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗后浸入封闭液中，室温封闭10 min，滴加50 μL末端脱氧核苷酸转移酶反应液，37 ℃湿润避光反应60 min。滴加50 μL链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液，37 ℃湿润避光反应30 min。滴加DAB工作液，室温显色反应10 min。苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。参照TUNEL试剂盒的操作说明，以细胞核呈棕黄色或棕褐色染色为凋亡细胞，分别计数高倍视野下100个细胞中凋亡细胞数为凋亡指数（AI）。3）检测3组小鼠耳蜗组织p38MAPK通路蛋白表达情况[7]：取部分蜗内组织，加入裂解液后冰上裂解30 min，BCA法定量后，取50 μg進行常规蛋白免疫印迹法（WB）检测，经图像分析系统分析3组细胞p-p38MAPK、p-CREB表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验，计数资料用频数表示，用χ2检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠ABR阈值的影响

与空白组比较，模型组8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR阈移升高（P<0.05），与模型组比较，实验组ABR阈移降低（P<0.05）。见表1。

2.2 3组小鼠螺旋神经节细胞凋亡比较

空白组螺旋神经节细胞形态清晰，细胞凋亡现象少;模型组螺旋神经节细胞核呈现棕黄色，凋亡现象明显，实验组凋亡现象较模型组明显减少，细胞形态清晰。模型组小鼠螺旋神经节AI较空白组升高，且实验组低于模型组（P<0.05）。见表2。

2.3 3组小鼠螺旋神经节中p38MAPK信号通路相关蛋白表达比较

模型组螺旋神经节p-p38MAPK、p-CREB蛋白相对表达量较空白组升高，而实验组较模型组降低（P<0.05）。见表3、图2。

3 讨论

铂类化疗药物在临床应用中除对肿瘤的高活性外，胃肠道毒性、神经毒性、肾毒性、耳毒性等不良反应也是不容忽视的问题，严重影响肿瘤患者的生命质量[8]。近来临床已采取相应措施防控铂类药物的肾毒性，但对于耳毒性的防治手段则较为落后，主要是因为对铂类药物耳毒性的发生机制尚不十分清楚。因此深入探讨铂类药物耳毒性机制对于耳毒性的防治提供依据尤为重要。

顺铂耳毒性的基本病因之一是内耳微循环障碍造成耳蜗缺血、缺氧、自由基产生增多而使耳蜗内的结构受到损伤，刺五加注射液主要成分为刺五加总黄酮，是由刺五加的茎叶制成中药制剂，多用于治疗缺血性心脑血管疾病，其药理作用包括扩张血管、促进和改善微循环、增加器官的血流量、减少组织耗氧量、清除自由基、调节机体新陈代谢和提高组织对缺氧的耐受性等[9-10]。本研究结果显示，连续5 d腹腔注射顺铂后，模型组小鼠8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR阈移明显高于空白组，表明经顺铂干预后小鼠出现明显的听力下降现象，而在实验组经刺五加注射液预处理后小鼠ABR阈移显著低于模型组。提示刺五加注射液可能通过增加耳蜗的血液循环、改善内耳缺血缺氧状态而减轻顺铂所致的毒性作用。研究指出，顺铂可诱导耳蜗NOX3表达水平的升高，促使细大量生成活性氧及发生脂质过氧化，进而MAPK/c-Jun氨基末端激酶细胞凋亡信号级联，激活Bcl-2家族中促凋亡成员，使线粒体内细胞色素C释放入胞质，使caspase-9和caspase-3蛋白转录激活后诱导耳蜗细胞发生凋亡，最终造成听力丧失[11-13]。研究表明，刺五加多糖具有抗肿瘤、增强免疫力等作用[14-15];刺五加叶皂苷通过开放ATP敏感性钾通道保护缺血心肌组织，降低组织损伤程度。张珊等[16]研究认为，刺五加注射液能抑制受损心肌细胞凋亡、减轻氧化应激损伤，有关有效减轻阿霉素诱导的大鼠心肌组织超微结构损伤，改善心功能。贾琳琳等[17]研究显示，刺五加注射液可通过抑制谷氨酸及其受体在耳蜗螺旋神经节中的过度表达，对螺旋神经节细胞起到保护作用。

本研究经TUNEL检测显示，模型组螺旋神经节细胞核呈棕黄色，凋亡现象明显，凋亡指数明显高于空白组，而实验组凋亡现象较模型组明显减少，细胞形态清晰，凋亡指数也较模型组明显降低。MAPK是调控细胞多种生理病理过程的重要信号传导途径，在细胞外信号的刺激下p38 MAPK信号通路磷酸化，激活下游转录因子，进而调控细胞的增殖、炎性反应和凋亡[18]。顺铂可激活MAPK信号通路[19];刘瑞婷等[20]发现，p38 MAPK通路的激活可导致神经细胞凋亡，p38 MAPK被磷酸化激活后，使效应细胞分泌多种细胞因子参与介导神经细胞损伤的过程。本研究结果显示，经刺五加注射液干预后实验组螺旋神经节p-p38MAPK、p-CREB蛋白相对表达量较模型组降低，提示其对顺铂导致的耳毒性的作用机制与调控p38MAPK信号通路蛋白表达抑制耳蜗细胞凋亡程序的发生有关。

综上所述，从听力学及耳蜗组织形态学等方面，本研究初步探讨了刺五加注射液拮抗顺铂耳毒性的作用，在后续的实验中会增加关于刺五加注射液作用浓度及作用时间的研究，进一步明确药物的最佳给药时间、浓度及方式等。

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（2019-09-05收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：内蒙古医科大学科技百万工程项目（KJbw2013014）作者简介：胡文良（1969.04—），男，硕士研究生，主任医师，研究方向：鼻息肉及耳聋耳鸣的治疗，E-mail：13664881598@163.com