金银花“华金6号”新品种体外抗病毒活性研究

李 哲，玄 静，赵振华，马 婷，张永清*

（1.山东中医药大学，济南 250355；2.山东省高校中药资源学重点实验室，济南 250355）

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥未开放花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热等功效，用于治疗痈肿疔疮、热毒血痢、温病发热等病症[1-2]，属于大宗常用中药材。主要含有绿原酸、黄酮、环烯醚萜等成分，其中绿原酸与木犀草苷为其质量指标成分[3]。现代研究结果显示[4-5]，金银花药理活性独特，在抗病毒作用方面具有显著优势，其毒副作用小，为温病治疗之要药。“华金6号”是本课题组选育出的金银花新品种，具有活性成分含量高、采收成本低等优点，推广应用前景广阔[6]，但其药理药效尚待深入研究。H9-AIV 属于致病性禽流感病毒，可引起家禽流行性疫病，甚至还可感染人、猪等哺乳动物[7]。为探讨“华金6 号”新品种抗病毒活性，本试验以金银花传统品种“大毛花”为对照，采用鸡胚尿囊腔接种及血凝（HA）试验，检测了二者体外抗H9-AIV 活性。本研究拟证实“华金6 号”金银花抗病毒活性，在此基础上，更好地推进该品种的推广种植，促进临床抗病毒药物的合理用药。

1 材料和方法

1.1 试验材料

药材：“华金6 号”新品种与“大毛花”传统品种药材均于2017年5 月份采自山东中医药大学药用植物园，晒干，备用。原植物经山东中医药大学李佳教授鉴定， 确认物种均为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.。

主要试剂：利巴韦林注射液（1 mL ∶0.1 g，批号：1701122611）；绿原酸对照品(购自中国食品药品检定研究所批号：110753-201716）。

病毒：H9 亚型禽流感病毒 S2 株（H9-AIVs2），由山东农科院家禽所禽病研究室提供。

鸡胚：9～11 日龄 SPF 鸡胚， 由山东昊泰特种动物繁育有限公司提供。

1%鸡红细胞悬液：采集健康鸡血液，4%柠檬酸钠抗凝（抗凝剂∶血液=1∶4），加入无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS），2 000 r/min 离心 5 min，洗涤 3 次，弃上清液。取沉淀红细胞，用PBS 缓冲液稀释配成1%鸡细胞悬液，4 ℃冷藏，备用。

主要仪器：生物安全柜（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-2FD 型）；孵化机（北京海江孵化设备有限公司）；液相色谱仪（岛津LC-20AD）；全波长扫描色谱工作站；低温高速离心机（德国Thermo）；高压蒸汽灭菌器（新华医疗设备有限公司）；电热恒温培养箱 （上海精宏实验设备有限公司）；KQ5200DB 型数控超声波清洗器；PH 仪（METTLER TOLEDO）；96孔V 型血凝板。

1.2 试验方法

1.2.1 提取物制备与绿原酸含量测定

1.2.1.1 提取物制备

经过预试验， 采用正交设计法优化提取工艺，确定最佳提取工艺为：称取金银花药材50 g，加15倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，9 号药典筛滤过，取药渣再加10 倍量水煎煮45 min，过滤，合并药液。浓缩至50 mL，相当于每毫升药液含1 g 原药材。浓缩液高压灭菌（115 ℃，45 min）后置 4 ℃冷藏，备用。体外试验时，取浓缩液置微量离心管中，用低温高速离心机10 000 r/min 离心10 min，取上清液。

1.2.1.2 绿原酸含量测定[8-9]

对照品溶液制备：精密称取适量绿原酸对照品，用50%甲醇配制成42 μg/mL 的对照品溶液。

供试品溶液制备：精密量取药材提取液2 mL于50 mL 棕色容量瓶，用50%甲醇定容，摇匀，检测时用0.45 μm 微孔滤膜滤过。

色谱条件：色谱柱：C18 反相色谱柱；流动相：乙腈-0.2%磷酸（13∶87）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；波长：327 nm。

在上述色谱条件下检测，得到对照品及供试品溶液峰面积，根据外标一点法计算绿原酸含量。

1.2.2 H9-AIV 增殖及效价测定

将H9-AIV 悬液与灭菌PBS 缓冲液以1∶1 000比例进行稀释处理， 提前将8 枚10 日龄的鸡胚做好接种点标记，采用尿囊腔接种法[10-13]进行接种。将接种后的鸡胚置37 ℃恒温箱培养96 h， 每12 h 照胚 1 次，弃去 24 h 内死亡鸡胚，收集 24～96 h 鸡胚尿囊液，测其血凝（HA）滴度并选取血凝滴度大于8的H9-AIV 作为试验病毒[14]。

1.2.3 H9-AIV 在鸡胚上半数感染量（EID50）的测定

用灭菌PBS 缓冲液将新鲜H9-AIV 作2 倍倍比稀释（10-1～10-12），提前将鸡胚做好接种点标记，每个稀释度的H9-AIV 病毒液分别接种于5 枚9～10日龄的 SPF 鸡胚尿囊腔内，0.1 mL/胚， 并设 PBS 对照组。接种完成后，将鸡胚置37 ℃恒温箱内培养，每12 h 照胚1 次，弃掉24 h 内的死亡鸡胚，取培养24～96 h 的鸡胚置 4 ℃保存。收取尿囊液做 HA 试验，将血凝板做好标记，每胚分别取0.1 mL 尿囊液依次加在血凝板上， 然后分别加入新鲜的1%鸡红细胞悬液0.1 mL，轻轻震摇，放置30 min 后观察结果，按 Reed Muench 法[15]计算。

1.2.4 最大不凝血浓度测定

取“华金6 号”新品种、“大毛花”传统品种金银花提取原液进行离心处理，取上清液用pH 值为7.4的PBS 缓冲液2 倍倍比稀释10 个浓度， 分别测定每个稀释度溶液的血凝效价，同时设PBS 对照和病毒组对照。

1.2.5 对鸡胚最大无毒浓度（TDO）测定

取“华金6 号”新品种与“大毛花”传统品种金银花提取原液作离心处理（10 000 r/min，10 min），分别取其上清液用灭菌PBS 缓冲液作两倍系列稀释（2-1～2-8），每个稀释度分别取 0.2 mL 接种在预先标记好的9～10 日龄SPF 鸡胚上，6 枚鸡胚为一个浓度组，并设PBS 对照。将接种好的鸡胚置37 ℃恒温箱内培养96 h， 每12 h 观察并记录鸡胚的存活情况，弃掉24 h 内的死亡鸡胚。

1.2.6 “华金6 号”新品种金银花、“大毛花”金银花体外抗H9-AIV 感染实验

1.2.6.1 体外直接抑制试验

根据最大不凝血浓度，用PBS 缓冲液将“华金6号”新品种、“大毛花”传统品种金银花提取液分别稀释成含生药 31.25、15.625、7.812 5 mg/mL 3 个浓度，每个浓度设4 组平行对照，每组分别加入等体积量100EID50 的H9-AIV，摇匀，将试管置37 ℃中和 1、4、8、16、24、48 h，分别测定不同时间、不同稀释度的HA 效价，同时设PBS 缓冲液对照组与病毒对照组[16]。试验结果见表 1。

1.2.6.2 中和试验

将药物提取原液从TDO 起以2 倍比稀释成125、62.5、31.25 mg/mL 3 个浓度， 各个浓度药液分别与等体积100EID50 的H9-AIV 悬液于37 ℃作用2 h。将中和液对提前做好标记的SPF 鸡胚进行尿囊腔接种， 每个稀释度分别接种6 枚SPF 鸡胚，0.2 mL/胚，于37 ℃恒温培养箱孵育48 h，取出鸡胚置-20 ℃放置2 h，收集鸡胚尿囊液，分别测定其血凝效价[17]。同时设利巴韦林对照组、病毒对照组及PBS 缓冲液空白对照组。试验结果见表2。

表1 体外直接抑制试验Table 1 Direct inhibition test in vitro

表2 中和试验Table 2 Neutralization test

1.2.6.3 预防试验

将药物提取原液从TDO 起以2 倍比稀释成125、62.5、31.25 mg/mL 3 个浓度， 各个浓度药液分别以每胚0.1 mL 的量接种6 枚鸡胚， 置37 ℃温箱孵育，并设利巴韦林对照组及PBS 空白对照组。温箱孵育 2 h 后， 用 0.1 mL 的 100EID50 的 H9-AIV悬液对每枚鸡胚分别进行接种， 于37 ℃的温箱孵育。48 h 后，从温箱内取出全部鸡胚置-20 ℃放置2 h，分别抽取鸡胚尿囊液，做HA 试验，测定血凝滴度。试验结果见表3。

表3 预防试验Table 3 Prevention trials

1.2.6.4 治疗试验

用0.1 mL 的100EID50 病毒悬液分别接种鸡胚，置37 ℃下孵育2 h，然后用与预防试验同样浓度的药物进行鸡胚接种， 每个浓度组接种6 枚鸡胚，设病毒、利巴韦林及PBS 缓冲液对照组，置37 ℃温箱孵育48 h，取出鸡胚于-20 ℃放置2 h，分别抽取鸡胚尿囊液，做HA 试验，测定血凝滴度[12]。试验结果见表4。

表4 治疗试验Table 4 Treatment trials

2 结果与分析

2.1 含量测定结果

在绿原酸对照品及金银花提取物样品色谱中，记录相同保留时间下的峰高，根据外标一点法计算样品中绿原酸含量。经计算得“华金6 号”新品种金银花提取物样品中绿原酸含量为0.925 5%，“大毛花” 金银花提取物样品中绿原酸含量为0.914 0%（见图 1～图 3）。

2.2 H9-AIV在鸡胚上半数感染量（EID50）

试验结果测得：EID50 为 10-8，试验用100EID50。

2.3 最大不凝血浓度

试验结果测得：“华金6 号”新品种与“大毛花”传统品种金银花提取物不引起血凝的最大浓度为62.5、31.25 mg/mL。

2.4 对鸡胚最大无毒浓度（TDO）

试验结果测得：“华金6 号”花蕾提取物的TDO为125 mg/mL，“大毛花” 金银花提取物的TDO 为125 mg/mL，利巴韦林注射液的TDO 为50 mg/mL。

2.5 两种金银花体外抗H9-AIV作用

“华金6 号”新品种金银花与“大毛花”金银花体外直接抑制H9-AIV 作用较强，与病毒对照组具有显著差异性（P＜0.05），“华金 6 号”金银花略优于“大毛花”金银花，且二者抗H9-AIV 作用在24 h 时达到最佳。

药物与病毒体外先中和再接种时，两种金银花均表现为高浓度抑制效果好， 低浓度抑制效果差，二者抑制作用相当（P＞0.05），高浓度药物对病毒的抑制作用明显高于利巴韦林组；“华金6 号”新品种金银花应用于鸡胚接种试验，在预防与治疗H9-AIV方面略高于“大毛花”金银花（P＞0.05），但二者作用效果均低于利巴韦林对照组（P＞0.05） 。

病毒对照组鸡胚在24 h 全部死亡，其他组鸡胚在96 h 后全部死亡，但“华金6 号”新品种金银花、“大毛花”金银花、利巴韦林阳性对照组在48 h 时仍能保证鸡胚有较高的存活率。

3 讨论与结论

本试验选用“华金6 号”新品种金银花水提液、“大毛花”金银花水提液对H9-AIV 进行体外抗病毒试验研究。结果证明，两种金银花对H9-AIV 均表现出较强的体外直接抑制作用， 且新品种略优于“大毛花”金银花。在用鸡胚尿囊腔接种试验测其抗病毒作用时，数据结果显示其疗效较弱且在96 h 时鸡胚全部死亡，但相比在24 h 时病毒对照组全部死亡，金银花组在48 h 时仍显示较高的存活率，存活时间明显高于病毒对照组。通过对各指标进行分析，“华金6 号”新品种金银花与“大毛花”金银花具有抗H9-AIV 作用且“华金6 号”新品种作用较好。当下，传统金银花面临采收时间集中，人工采收成本高等问题，而本课题组定向培育的“华金6 号”新品种最大的特点是花蕾开放集中，产量高。“华金6号”大白期花蕾持续时间长达15 d，在很大程度上延长了采收期，提高了采收效率。王玲娜等[18]研究结果显示“华金6 号”金银花中的绿原酸和木犀草苷的含量在花蕾生长发育期内比2015年版《中华人民共和国药典》规定含量分别提高了50.9%、168.0%，其应用前景十分广阔。

图1 绿原酸对照品HPLC 图谱Figure 1 HPLC spectrum of chlorogenic acid reference substance

图2 “华金6 号”新品种金银花样品HPLC 图谱Figure 2 HPLC spectrum of Lonicerae japonicae Flos new variety ‘Hua jin 6’

图3 “大毛花”金银花样品HPLC 图谱Figure 3 HPLC spectrum of Lonicerae japonicae Flos ‘Da mao hua’

应用鸡胚接种试验测得金银花组相比病毒对照组48 h 后存活率高，但最终血凝试验所得血凝效价较高，原因可能在于鸡胚内环境与病毒在机体增殖环境相符，当药物与病毒在鸡胚内充分反应的同时，病毒一直处于不断的增殖中，而鸡胚试验不能保证持续用药，因此试验最终测得血凝结果是一次用药对不断增殖的病毒的作用。鸡胚试验相对简便，较CPE 法更加符合机体内环境，适用于抗病毒药物的体外筛选比较[19-20]，因此该研究应用鸡胚试验对两种金银花体外抗病毒作用进行比较，结果得“华金6 号”新品种金银花的抗病毒作用可达“大毛花”金银花作用，综合其采收期较长的优势，可为其推广种植提供一定的依据。

近年来，抗病毒药物的使用多集中在化学药物上，其作用效率较高，但其对机体的副作用也日益突出，严重影响机体健康。我国中药资源丰富，且其具备很多化学药物没有的优点，因此，抗病毒中药日益成为研究热点，基于众多学者大量的研究工作，大青叶、金银花、黄芩、羌活等中药已被证明具有一定的抗病毒作用[21-22]，且大多抗病毒中药具有广谱性、袪邪不伤正、毒副作用小等优点[23]。金银花提取液作为天然抗病毒中药，国内外学者对其研究日益深入，研究表明绿原酸、木犀草苷、咖啡酸为金银花抗病毒的主要活性成分[24-25]，另有研究通过体内抗病毒试验表明金银花中的多糖成分可通过增强机体免疫力来发挥一定的抗病毒作用[26]。由于不同中药在复杂的机体内环境中作用机制亦不相同[27-28]，抗病毒中药作用机理也有差异，研究发现中药抗病毒作用与阻断病毒蛋白质复制、抑制病毒吸附、解热抗炎、提高机体免疫力等多种药理活性有关[29]，为深入了解“华金6 号”新品种金银花抗病毒机制及其主要药效成分，需从其分子作用机制等方面进一步研究。

“华金6 号”新品种金银花具有明显的抗病毒活性，且与平邑地产“大毛花”品种比较，其抗病毒效果略高。综合其活性成分含量高、采收期长、采收成本低等优点， 可更好地推进该品种的推广种植，促进临床抗病毒药物的合理用药。