组蛋白H3的甲基化修饰与脂肪细胞分化关系的研究进展

武晓慧，杨 帆，陈佳琪，刘婉莹，周秋安，魏婉丽※

(西安医学院 a.肥胖与代谢病研究所，b.临床医学院，西安 710021)

肥胖是当今世界最严重的公共卫生问题之一，是导致目前主要慢性非传染性疾病发展的独立危险因素，心脑血管疾病、糖尿病、脂肪肝[1]、部分恶性肿瘤(子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、大肠癌等)[2-3]以及抑郁症和焦虑症[4]的发生均与其有关，由此造成巨大的医疗负担[5]。最新的数据显示，全球18岁以上人群中超重人数已超过19亿，其中有6亿人达到肥胖水平[6]，我国是全球肥胖人数最多的国家[7]。

肥胖主要表现为能量在脂肪细胞内过度蓄积，常伴有脂肪细胞分化异常。深入研究脂肪细胞的分化有助于了解肥胖的形成机制并寻找新的治疗途径。脂肪细胞根据其形态、分布及功能的不同可分为白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞3类。其中棕色和米色脂肪细胞因可以通过产热消耗大量的能量，是肥胖治疗研究的新靶点。脂肪细胞的分化研究已不再局限于对单个基因功能的探索，在调控多个基因表达的表观遗传领域也有大量研究，并取得了较大进展。目前已发现大约50个转录和表观遗传调节物正向或负向调节棕色和米色脂肪细胞的分化[8]。现对这3类脂肪细胞的形态特点与组织分布、脂肪细胞的分化起源，及组蛋白H3的甲基化修饰对脂肪细胞分化调控作用的研究进展进行综述。

1 脂肪细胞的分类和组织分布

1.1白色脂肪细胞 白色脂肪细胞内含有单个大脂滴，细胞质和细胞核被挤压到边缘(图1a)，线粒体等细胞器不发达。白色脂肪细胞的主要功能是以三酰甘油的形式将多余的能量储存在细胞内，以备不时之需。

白色脂肪遍布全身皮下和内脏周围。其分布形式在个体间差异较大，并可因遗传、年龄、糖皮质激素的使用等发生分布的变化。在营养条件良好时，白色脂肪可以持续积累，尤其在内脏周围如大网膜、肠系膜等部位更为明显，与代谢性疾病(胰岛素抵抗、2型糖尿病、血脂异常、高血压等)、动脉粥样硬化、肝脏脂肪变性和癌症的发生密切相关，而皮下脂肪的积聚则与改善的胰岛素敏感性和2型糖尿病低风险有关[9-13]。但皮下脂肪增加导致的超重仍与骨性关节炎等密切相关[14]。

1.2棕色脂肪细胞 棕色脂肪细胞内含有多个小脂滴(图1b)，并富含线粒体。棕色脂肪细胞的线粒体体积较大，嵴丰富，使得内膜面积增大，这种结构特点与低温环境下快速产热的需求相适应。线粒体内膜上分布有解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)，可以解偶联氧化磷酸化反应而产热。

棕色脂肪产热时首先消耗自身脂滴内储存的三酰甘油，还可从外周血中主动吸收葡萄糖和脂肪酸，维持氧化和产热过程，消耗大量的能量。棕色脂肪主要分布在人类的肩胛间区、肾周围、颈部、纵隔等区域，啮齿类动物主要分布在肩胛间区和肾脏周围。多种啮齿类动物在成年后仍保留较多的棕色脂肪组织，以帮助其适应寒冷环境。以往观点认为，婴儿肩胛间的棕色脂肪随着生长发育逐渐减少乃至消失[15-16]。近年来一些针对人体开展的研究采用正电子发射计算机断层成像扫描显示，成人体内有棕色脂肪组织的存在，且其含量与受试者的体质指数、体脂含量及空腹血糖水平呈负相关[17-20]。另外慢性冷刺激可以在之前未能检测出棕色脂肪库的受试者中诱导出棕色脂肪，这可能是源于新的产热脂肪细胞的分化，从而导致非战栗产热的增加和胰岛素敏感性的改善[21-24]。

1.3米色脂肪细胞 米色脂肪细胞散在分布于白色脂肪组织中，形态上具有与棕色脂肪细胞类似的多泡状脂滴并富含线粒体(图1c)，也可以通过UCP1解偶联氧化磷酸化产热来消耗能量，但米色脂肪可以表达一些特异的标志基因，如肿瘤坏死因子受体超家族成员9(又称CD137)、穿膜蛋白26及T-盒蛋白1等[25-28]。米色脂肪细胞被称为“诱导型棕色脂肪细胞”或“白色脂肪中的棕色脂肪细胞”，其可被诱导的现象又被称为“白色脂肪棕色化”或“褐变”。研究表明，成人颈深部脂肪组织显示出经典棕色脂肪的表型特征[16,29]，锁骨上区棕色和米色脂肪均有分布[30]，因而认为成年人体内米色脂肪细胞和棕色脂肪细胞共同存在[31-32]。

米色脂肪细胞可以被许多环境因素或化学物质所诱导，如寒冷、去甲肾上腺素、鸢尾素、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)激动剂罗格列酮等。米色脂肪在应对寒冷刺激时可以发生高效产热，几乎与棕色脂肪相等[24]。如果能诱导人体内的米色脂肪细胞分化增加，则能利用其产热耗能作用治疗肥胖和2型糖尿病，特别是体内棕色脂肪含量较少的老年肥胖人群[33-34]。

6周龄C57BL/6J小鼠组织切片苏木素-伊红染色照片 a：白色脂肪细胞；b：棕色脂肪细胞；c：米色脂肪细胞；黄色箭头所指处为白色脂肪细胞，蓝色箭头所指处为米色脂肪细胞(Scale bar=75 μm)

图1 三种脂肪细胞的形态特点

2 脂肪细胞的起源及分化

脂肪组织在全身能量平衡中处于中心地位。白色脂肪以三酰甘油的形式储存过剩的能量，而棕色和米色脂肪以产热的形式耗散能量。由此看来，机体具有一定的调控能量存储稳态的能力。而肥胖的产生可能是由于耗能能力相对处于弱势。大规模的临床调查研究发现，棕色脂肪或米色脂肪的增加与体重和葡萄糖耐量、高脂血症的改善密切相关[35-37]，因而明确脂肪细胞的分化调控，尤其是这两类产热性脂肪细胞的分化调控机制，对于肥胖及其并发症的治疗具有重要意义。

三种类型的脂肪细胞均来源于间充质干细胞是目前的普遍认识。体内的谱系追踪研究表明，表达早期肌源性因子-肌生成因子5(myogenic factor 5，MYF5+)的细胞可以分化为骨骼肌细胞及肩胛间区和肾周的棕色脂肪细胞[38-39]，而白色脂肪细胞主要由MYF5-的前体细胞分化而来。此外，可被β3肾上腺素受体激动剂或冷刺激诱导的白色脂肪中出现的米色脂肪细胞为MYF5-，表明经典棕色脂肪细胞的起源与米色脂肪细胞的来源不同，而白色和米色脂肪细胞可能有共同的起源[40]。经典的棕色脂肪前体细胞除MYF5外，还有其他的标志物，如配对盒蛋白7[41]。

3 组蛋白H3甲基化修饰对脂肪细胞分化的调控

表观遗传是一种遗传调控机制，影响基因转录而不改变DNA序列。表观遗传调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA的调控等多种形式[41]。表观遗传调控机制可能通过激活或沉默脂肪细胞分化关键基因的表达来实现调控脂肪细胞分化的作用。其中许多调控因子通过影响PPARγ、CCAAT增强子结合蛋白家族(CCAAT enhancer binding proteins，C/EBPs)和含PR同源结构域的蛋白16发挥作用。

3.1组蛋白修饰的分类与组蛋白修饰酶 组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2个单位组成八聚体，145～147个DNA碱基对盘绕其上，构成核小体的核心颗粒，每个核心颗粒之间由含60个碱基对的DNA链及1个组蛋白H1的连接区相连接。组蛋白除作为骨架提供DNA盘绕的支撑结构外，氨基酸链上的残基位点也可被修饰，如发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等修饰，影响基因的转录[42]。这些修饰与染色体失活、异染色质形成、沉默或激活基因的表达、细胞及个体发育等联系密切。

3.2组蛋白的甲基化和去甲基化修饰 组蛋白甲基化常发生在H3和H4的N端的精氨酸或赖氨酸残基上，甲基化后通用的表示方法：如组蛋白H3的27位赖氨酸甲基化，则表示为H3K27me[43]。根据该位点甲基化程度的不同，组蛋白甲基化包括一、二和三甲基化，分别表示为H3K27me1、H3K27me2和H3K27me3。组蛋白甲基化酶(或称甲基转移酶)或去甲基化酶的表达、活性和招募都通过影响组蛋白状态、染色体的结构及基因转录在机体发育和生理活动中发挥作用。

3.3常见组蛋白H3甲基化和去甲基化位点修饰酶与脂肪细胞分化的关系 组蛋白H3赖氨酸残基位点的甲基化修饰是最常见的翻译后修饰之一，如H3K4、H3K9、H3K27等位点的甲基化。甲基化后，根据位点的不同发生基因的转录激活或沉默[44-45]。几种组蛋白甲基化酶和去甲基化酶，通过调节组蛋白甲基化修饰状态在棕色脂肪的发育和产热基因的表达方面发挥重要作用[46]。

3.3.1H3K4 组蛋白赖氨酸甲基转移酶2C(lysine methyltransferase 2C，KMT2C，又称MLL3)及其同源物赖氨酸甲基转移酶2D(lysine methyltransferase 2D，KMT2D，又称MLL4)通过催化H3K4甲基化在细胞种类特异性基因的增强子区域起作用。敲除Mll3的小鼠白色脂肪和棕色脂肪均发生基因表达改变。尤其是在棕色脂肪组织中，超过500个基因的表达发生改变，其中46%与代谢相关。此外，敲除该基因的小鼠有较瘦的表型、血糖水平降低以及胰岛素敏感性升高。这些结果提示Mll3在调节棕色脂肪功能中的作用[47]。

组蛋白甲基化的调控因子-Pax蛋白相互作用的反式激活域是MLL4的组分之一，Cho等[48]报道此因子对于Pparγ和C/ebpα的基因表达是必须存在的，在小鼠胚胎成纤维细胞和前脂肪细胞的分化中也必须存在。脂联素基因驱动cre条件性敲除Pax蛋白相互作用的反式激活域的小鼠，虽然体重与对照组相似，但棕色脂肪组织含量减少了50%，白色脂肪和棕色脂肪共同的基因及棕色脂肪特有的基因以及线粒体基因在棕色脂肪组织中的表达也减少[49]。由于棕色脂肪组织通过线粒体进行产热，这些小鼠在冷刺激实验中体温下降更为显著，提示Mll4对棕色脂肪细胞分化和功能有重要作用。

3.3.2H3K9 赖氨酸去甲基化酶3a(lysine deme-thylase 3a，KDM3a，又称JHDM2a)可特异地催化H3K9的去甲基化。研究发现，Jhdm2a基因敲除的小鼠表现出肥胖表型[50]且能量消耗明显下降[51]，同时棕色脂肪功能也发生变化，表现为线粒体基因表达减少及氧耗量下降。此外，在β肾上腺素刺激下，Jhdm2a在丝氨酸265(S265)位点上被蛋白激酶A磷酸化，增加与SWI/SNF染色质重塑复合物及与Pparγ的相互作用，除H3K9去甲基化外，发挥其他附加作用[52]。

植物同源结构域指蛋白2是一种H3K9me2的去甲基化酶，含有JmjC结构域。植物同源结构域指蛋白2可以促进小鼠脂肪积累[53]，在3T3-L1细胞敲除植物同源结构域指蛋白2后，Pparγ和C/ebpα的表达均明显减少[54]。

赖氨酸特异性去甲基化酶1a(lysine specific demethylase 1a，KDM1a，又称LSD1)是特异性介导H3K9me1/2去甲基化的另一种酶，通过与锌指蛋白516的直接相互作用，将LSD1募集到产热基因附近的H3K9位点，催化甲基移除，从而激活这些基因并促进体内产热脂肪的功能[55]。在小鼠中使用Ucp1驱动Cre敲除Lsd1将损伤棕色脂肪细胞分化和功能，导致棕色脂肪“白色化”，即形成含单个脂滴的棕色脂肪细胞[56]。

常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶1(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1，EHMT1)，催化H3K9二或三甲基化(H3K9me2/3)。在小鼠中由脂联素驱动的Cre脂肪特异性敲除Ehmt1，导致小鼠背部棕色脂肪组织体积小、含量少，棕色脂肪细胞丧失多泡状小脂滴的特征，表现为单个脂滴，棕色脂肪的适应性产热及氧耗量减少。白色脂肪脂滴增大，小鼠出现肥胖、脂肪肝和全身胰岛素抵抗，提示Ehmt1是控制棕色脂肪细胞分化和能量代谢的重要开关[57]。

常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1，EHMT2，又称G9a)，可以催化H3K9me2的形成[58]，与基因沉默有关。当使用G9a抑制剂或用小干扰RNA抑制mRNA时，可以通过增加Pparγ和C/ebpα的表达，并抑制Wnt10a的表达，最终使脂肪形成增多[59]。

3.3.3H3K27 多梳族基因是重要的表观遗传修饰基因家族，包括两个重要的复合物类型：多梳蛋白抑制性复合物1和多梳蛋白抑制性复合物2。复合物2由果蝇zeste基因抑制因子12、胚胎外胚层发育因子等蛋白基团与果蝇zeste基因增强子的人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)聚合而成[60]，EZH2是复合物2中唯一具有酶活性的催化亚基，含有SET结构域。多梳蛋白抑制性复合物2通过EZH2催化H3第27位赖氨酸(K)位点的一、二和三甲基化，H3K27甲基化后常导致基因的沉默[61-62]。H3K27me3形成后，多梳蛋白抑制性复合物1通过其亚基Chromobox同源物(CBX)识别H3的甲基化位点并与之结合，通过另一个催化亚基环指蛋白1催化组蛋白H2AK119发生单泛素化，抑制由RNA聚合酶Ⅱ催化的转录延伸反应，最终造成靶基因的转录沉默[63-64]。

目前所了解的H3K27去甲基化酶主要有赖氨酸特异性去甲基化酶6a[lysine(K)specific demethylase 6a，Kdm6a，因位于X染色体上，又称UTX]和Kdm6b(又称JMJD3)[65-66]。H3K27me2/3的甲基化平衡主要是由EZH2和JMJD3/UTX维持。UTX和 JMJD3均为含有JMJC结构域的蛋白，可以催化H3K27me2和H3K27me3的去甲基化。除含有 JMJC 结构域外，UTX还含有四肽重复基序，介导蛋白质-蛋白质相互作用。H3K27由JMJD3/UTX催化的去甲基化过程是在Fe2+、O2和α-酮戊二酸的辅助下，JMJD3的JMJC结构域催化H3K27me3中赖氨酸残基的氨基发生羟基化，而后赖氨酸残基脱下甲醛，形成去甲基化的赖氨酸残基[67]。

实验结果发现，在大部分胚胎干细胞中，Ezh2和H3K27me3修饰多聚集在生长和分化相关基因的转录调控区域[68]。研究表明，抑制Ezh2可以避免间充质干细胞向骨的分化，Ezh2介导间充质干细胞向骨或脂肪细胞分化方向的转换[69]。在小鼠前脂肪细胞中，Ezh2和H3K27me3在多个Wnt基因(如Wnt1、Wnt6、Wnt10a)位点处聚集，通过抑制Wnt信号通路促进脂肪细胞生成，在小鼠白色和棕色前脂肪细胞的分化中发挥重要作用[70]。用Ezh2特异性酶活性抑制剂GSK126处理高脂饮食诱导的肥胖小鼠，可以通过增加米色脂肪细胞的分化并促进棕色脂肪细胞的功能，减轻小鼠体重，这些证据都表明Ezh2和H3K27me3对棕色和米色脂肪的分化具有潜在的重要作用[71]。

Utx在棕色脂肪细胞分化过程中发挥重要作用[72]。在β肾上腺素能神经递质刺激下，Utx被招募到Ucp1和Pparγ共激活因子α启动子区，降低H3K27me3水平，从而诱导产热基因从抑制状态到激活状态的转换。Jmjd3也可以促进棕色脂肪细胞的分化。过表达Jmjd3的小鼠体重减轻，而Jmjd3的敲除则降低了小鼠的寒冷耐受能力。Jmjd3还可以促进白色脂肪棕色化[73]。

4 小 结

对脂肪细胞，尤其是棕色和米色脂肪细胞分化调控的深入研究给肥胖等代谢性疾病的治疗带来了新的希望，然而利用棕色和米色脂肪的耗能治疗肥胖仍处于研究阶段，有大量的问题尚未解决。例如表观遗传调控因子可否作为棕色和米色脂肪细胞的分化和治疗肥胖的靶点并开发安全、有效和具有特异性的药物等。探索表观遗传调控因子对于小鼠脂肪细胞分化的影响，将为人类深入了解脂肪细胞分化和肥胖及其相关疾病的治疗提供新的理论基础。