miR-143在肝脏组织中的表达及调控机制

2019-09-21 08:58刘永庆王成宏童钟
贵州医药 2019年8期
关键词:孔板细胞株靶向

刘永庆 王成宏 童钟

(合肥市第一人民医院肝胆外科,安徽 合肥 230601)

肝癌是世界范围内高发生率(第五)高死亡率(第三)的癌症之一[1-2]。肝炎病毒的感染是肝癌发生的主要因素(约占80%)3。其他因素,如酒精摄入,肥胖,肝硬化,吸烟甚至是糖尿病皆是肝癌发生的诱导因[4-8]。此外,基因突变及染色体异常也在肝癌发生发展中占据主导地位[9-12]。微小RNA作为一种小的非编码核糖核酸可以通过碱基互补配对与靶基因结合,进而沉默靶RNA或者抑制RNA转录后表达[13]。其中miR-143参与多种癌症的发生发展。本研究旨在探讨miR-143在肝癌组织中的表达情况,以及进一步敲低miR-143后,通过调节SHP2-ERK1/2信号通路来升高肝癌细胞中肝细胞的比例,从而加重肝癌细胞的恶性程度的调控机制。

1 材料与方法

1.1材料 20例肝癌组织样本以及正常的20份肝组织来源于安徽省合肥市滨湖医院,所有涉及人类参与者的操作程序都符合合肥市滨湖医院伦理委员会要求,且皆获得参与此研究涉及的个体的知情同意。人类肝癌细胞HepG2和正常人肝上皮细胞HL02购于美国ATCC细胞库,人肝癌细胞系SMMC-7702细胞系购于上海慧颖生物科技有限公司。miRNA-143的相关引物购于invitrogen公司。肝癌组织以及肝癌细胞的miRNA提取是通过大连Takara公司的miRvana miRNA 试剂盒。miR-143 inhibitor以及miR-143-mimic购买于上海汉恒公司。Transwell 小室购于康宁公司。流式抗体CD133-APC购于BD pharmingen公司,乙醛脱氢酶活性检测试剂盒购于北京索莱宝有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 HepG2,HL02以及SMMC-7702细胞皆采用相同的细胞培养方式进行无菌培养,即细胞培养所用培养基为DMEM加10%的胎牛血清和1%的双抗(青霉素与链霉素)。所有的细胞培养试剂皆购买于美国Gibco公司。此外,所有的细胞皆培养于无菌细胞培养箱中(37 ℃,5% CO2)。

1.2.2RNA提取及实时荧光定量PCR实验 采用miRvana miRNA试剂盒提取细胞的总的miRNA。miR-143的检测采用大连Takara公司的primescript RT reagent试剂盒。细胞或组织中的miRNA提取方法具体如下:1、裂解组织。采用1ml RNA reagent裂解细胞或组织,将匀浆置于室温2-3分钟,接着加入氯仿,震荡15秒,之后冰浴10分钟。冰浴后4摄氏度离心15分钟,取上层水相为RNA。2、去除RNA。将RNA转移至新的离心管中,加入2 mL RNA mini column中,室温离心30-60秒(1000g)。3、miRNA的分离纯化。加入十分之九的无水乙醇至离心管中,涡旋混匀,加入 RNA mini column中并加入吸附柱中,弃除流出液。最后加入500ulRWB wash buffer,离心30~60秒。最终洗脱miRNA,室温静置5分钟,13000g离心一分钟。将获取的miRNA逆转录产物加入qRT-PCR反应所需试剂进行PCR反应。GAPDH用来作为内参。GAPDH前引物序列为:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,后引物序列为:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’;miR-143前引物序列为:5’.GCGGCGGTGAGATGAAGCACTG-3’,后引物序列为:5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。

1.2.3细胞慢病毒感染实验 miR-143的siRNA(si-miR-143)及其阴性对照(si-NC),miR143的过表达质粒皆购买于上海汉恒生物科技有限公司。这些载体质粒的感染实验是采用脂质体2000试剂盒进行,具体操作如下1)铺板:感染前一天将HepG2和SMMC-7721细胞各按3×104cell/孔的密度接种于24孔板中,并分组为Lv-hsa-miR-143 NC,Lv-hsa-miR-143 mimics,Lv-hsa-miR-143 inhibitor,每组设3个副孔,保证第二天感染时其细胞密度达到50%左右。(2)稀释试剂:转染前用DMEM培养基稀释Polybrene(10 mg/mL),按1∶200稀释,使其浓度为50 μg/mL,配制感染体系时终浓度为5 μg/mL,即为 Polybrene(M)。病毒滴度为1×107TU/mL。(3)感染前换液:感染前8 h换成新配DMEM完全培养基。(4)感染:每组将1 200 μL细胞悬液、150 μL virus稀释液、150 μL Polybrene(M)混合在一起,配成1 500 μL培养体系,按分组加入相应的病毒混合液进行细胞感染。(5)感染后换液:感染后8~12 h更换DMEM完全培养基。(6)观察荧光强度。(7)细胞筛选:1)稀释嘌呤霉素:将25 mg的嘌呤霉素粉末离心至管底,然后加入1 mL高压灭菌过的超纯水,使其浓度为25 mg/mL,置于-20 ℃冰箱保存。2)铺板:将待筛选细胞种植在24孔板里培养,使细胞密度为70%左右。3)筛选药物浓度:待细胞贴壁后,在培养基中加入嘌呤霉素,设置不同的浓度梯度进行筛选,24~48 h观察细胞状态,最终得出HepG2细胞加入嘌呤霉素后最低致死浓度为2 μg/mL,而SMMC-7721细胞最低致死浓度为1.5 μg/mL。4)换液时加入嘌呤霉素。(8)建立稳定细胞株:待所有细胞均有荧光表达时即可停止筛选,扩大培养获得稳定表达目的基因的细胞株。

1.2.4细胞行为学实验 采用平板克隆实验检测细胞的增殖能力,即收集细胞,每个孔中种500个细胞(6孔板),加入2 mL完全培养基,放于孵箱中培养14天。用PBS清洗6孔板,晾干后加入0.1%结晶紫染色1小时左右,清洗并拍照。采用细胞迁移实验检测细胞的迁移能力。具体方法如下:就是在6孔板中种3×105个细胞,加入5 00 μL完全培养基。在细胞培养箱中培养20小时,清洗染色,并拍照。细胞侵袭实验首先要将基质胶均匀铺于24孔板中,加入3×104个细胞,并加入500 μL完全培养基。放入培养箱中培养20小时左右,清洗培养皿并拍照。

1.2.5荧光素酶报告实验 实验前一天取一块96孔进行铺板, 不同处理的细胞按1×104个/孔种细胞,加入75 μL DMEM培养基进行培养。第二天将设计的miR-143与SHP2的不同质粒(突变与未突变)进行共转染。1.按照polyplus说明书操作。每个位点分三组,每组剂量实验设置三个复孔,计算每组共需的试剂总量,配制好后加入到每个实验孔中。5 μL buffer +200 ng DNA +0.3 μL reagent +培养基=75 μL体系,最后每孔平均加入7 μL转染体系。转染后放入培养箱48 h后取出;最后通过多功能酶标仪测其荧光值。计算萤火虫/海肾比值,计算相关性分析数据。

1.2.6流式细胞实CD133阳性的肿瘤干细胞的定量本采用流式细胞术来测定。先收集不同处理的肝癌细胞,测定总细胞数,取1×106个细胞(用含10%FCS,1%叠氮化钠的冰冷PBS重悬)。向每根离心管中添加100ul细胞悬液。按照1:200的比例添加一抗(CD133,Thermo,兔来源),室温孵育40分钟。离心洗涤后再加荧光二抗进行孵育(室温30分钟),离心洗涤后上机检测。

1.2.7乙醛脱氢酶活性检测实验 采用乙醛脱氢酶活性检测实验用来检测肝癌细胞的干性。本实验将采用细胞数量(1×104个):提取液体积(mL)为 500~1 000:1 的比例(建议 500 万细胞加 入 1 mL 提取液),接着通过冰浴超声波法破碎细胞(功率 300 w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 10 000 g, 4 ℃,离心 20 min,取上清置于冰上待测。紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。 将试剂一 37 ℃(哺乳动物)预热 15 min。最后按照蛋白浓度计算其酶活性值。

1.2.8细胞总蛋白提取及western blot实验 将孔板或细胞培养皿置于冰上,用1ml枪头吸出培养基,用预冷的PBS溶液洗涤细胞2遍。于培养板或培养皿中加入已溶解过蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,充分混匀,放置 4度摇床或冰上快速摇晃15~20 min使裂解液浸入到所有细胞起到充分裂解细胞的作用。如果检测的目的蛋白未磷酸化蛋白在裂解液中还应加入磷酸酶抑制剂(细胞裂解液:磷酸酶抑制剂=100:1)。用细胞刮刮取细胞,吸取细胞碎片和裂解液的混合液至1.5 mL EP管中,4 ℃离心 12 000 rpm 20 min,将蛋白上清吸出转移至新的 1.5 mL EP 中并标记,也可将细胞消化后收集沉淀并用PBS清洗一遍后加入蛋白裂解液进行后续实验。最后,将相同量的蛋白加入进行丙烯酰胺胶中进行电泳,然后继续转膜,将PVDF膜放入1%的脱脂牛奶中封闭1个小时。之后,加入一抗,放入4℃冰箱进行过夜孵育。第二天先洗膜,再加入二抗孵育1.5小时。洗涤后通过ECL试剂盒进行显影。

1.3统计学方法 所有实验数据均采用SPSS17.0 统计软件的t检验分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1miR-143在肝癌组织及细胞系中呈低表达趋势 miR-143在肝癌组织中呈低表达趋势(P<0.01)。见图1A。miR-143在肝癌细胞中的表达水平显著低于正常肝细胞,且miR-143在SMMC-7721细胞中的表达水平是显著高于HepG2。见图1B。

注:A.qRT-PCR用来检测miR-143在肝癌组织与正常组织中的表达水平;B.qRT-PCR用来检测肝癌细胞株与正常肝细胞中miR-143的表达。

图1miR-143在肝癌组织及细胞中的表达

2.2miR-143的敲低对肝癌细胞恶性增殖的影响 MiR-143的高表达能够抑制肝癌细胞的增殖(图2A-C),但是并不影响其转移以及侵袭能力。miR-143的敲低能够促进肝癌细胞的增殖能力而并不影响其转移以及侵袭能力(图2A-C)。

注:A.克隆形成,transwell without matrigenl以及transwell with matrigenl实验分别用来检测miR-143过表达对肝癌细胞克隆形成能力,迁移和侵袭的影响;B.克隆形成,transwell without matrigenl以及transwell with matrigenl实验分别用来检测miR-143低表达对肝癌细胞克隆形成能力,迁移和侵袭的影响;C.双尾的学生T检验用来对miR-143高低表达对肝癌细胞恶性生物学行为的影响进行统计学分析。

图2miR-143的敲低对肝癌细胞增殖能力的影响

2.3miR-143的敲低对肝癌细胞中的干细胞比例的影响 miR-143的敲低可以显著提高SMMC-7721细胞株中CD133+干性样细胞的比例。与之相反,miR-143的抬高,能够显著下调CD133+的干细胞比例。miR-143的敲低能够促进肝癌细胞乙醇脱氢酶的活性,反之则会抑制乙醇脱氢酶的活性。见图3。

注:A.流式分析用来检测miR-143高低表达的肝癌细胞株中CD133阳性的肿瘤干细胞比例;B.ALDH活性实验用来检测miR-143高低表达的肝癌细胞株中ALDH的活性。

图3miR-143的敲低对肝癌细胞中干细胞比例的影响

2.4miR-143靶向SHP2调节ERK磷酸化 为了验证miR-143与SHP2之间的关系,我们通过western blot检测了miR-143高表达的肝癌细胞中SHP2的表达,结果表明,miR-143的敲低能够升高SHP2的蛋白表达(图4C),反之也成立。采用双荧光素酶报告实验证实了miR-143与SHP2的靶向关系。并且,我们还检测了SHP2下游的ERK1/2信号通路,结果显示,miR-143能够调控SHP2/ERK1/2信号通路的活化。见图4。

注:A.targetscan数据库用来分析miR-143的靶基因;B.双荧光素酶报告基因实验用来分析miR-143与SHP2相互作用;C.western blot用来检测miR-143高低表达的肝癌细胞株中SHP2以及其下游的ERK磷酸化情况。

图4miR-143与SHP2的靶向关系

3 讨 论

miRNA是一类小的非编码RNA,它在肿瘤的发生发展中的多种信号通路中都扮演着重要的角色[14]。也就是说,miRNA可以靶向于肿瘤相关基因,促进或者是抑制肿瘤的发生发展。有示miR-143在肝细胞癌中呈低表达趋势,且在外周血中也是相同趋势[15]。这就表明miR-143很可能在肝癌的发生发展中起着重要的作用。为了探究miR-143的表达及其机制。本研究选取20例肝细胞癌症患者(此类患者皆未接受放射,化疗以及靶向药治疗)进一步验证miR-143表达,结果表明miR-143在肝癌患者中的确呈现低表达趋势,不管是组织抑或是细胞水平。为了进一步探究miR-143在肝癌细胞中的作用。我们在miR-143高低表达的细胞株中相应地敲低或者抬高其表达来验证miR-143在肝癌细胞恶性生物学行为中的作用。很有意思的是,miR-143的差异表达并不会影响其转移及侵袭能力,反而会增强其增殖,克隆形成能力。由此我们假设,miR-143是否会影响其细胞干性。通过检测CD133阳性细胞的比例,结果表明CD133阳性的细胞比例明显上升,并且乙醛脱氢酶活性验证了miR-143的敲低会升高肝癌细胞的干细胞比例。事实上,已经有相当数量的报道提示miR-143与肿瘤的侵袭转移密切相关[16-17]。而肿瘤的侵袭与转移与肿瘤干细胞紧密相连。大多数肿瘤的治疗往往历经较差预后,这与肿瘤细胞已经转移,手术清扫不干净,靶向药药效有限等等密切相关。其中肿瘤干细胞理论引起领域内学者广泛关注。理论上来说,肿瘤细胞(尤其是上皮样细胞)可以通过上皮间质样转化,改变肿瘤细胞的极性,可塑性[18]。重编程的肿瘤细胞能够适应更加恶劣的环境(例如化疗,放疗甚至是靶向药治疗),作为一类种子细胞,待时机成熟,进行定居,归巢,进而恶性增殖[19]。为了进一步探究miR-143是如何影响肿瘤干细胞的比例。本研究通过生物信息学软件预测其靶基因,其中,SHP2因其在肝癌中的高表达以及其与肿瘤干细胞关系密切引起我们的注意。荧光素酶报告基因实验也验证了miR-143与SHP2的确相互作用。接下来我们又验证了SHP2下游的ERK信号通路的活化情况。结果同样表明EKR的磷酸化与miR-143的低表达呈现负相关调控关系。以上结果均揭示了miR-143-SHP2-ERK信号通路调控了肝癌干细胞的比例。

综上所述,此研究揭示了miR-143低表达影响肝癌恶性程度的机制,为肝癌的基础研究,尤其是肝癌干细胞的研究提供一个新的视野。更为重要的是,此研究也为肝癌的临床研究添加一个新的治疗靶点。

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