微孔淀粉对2,4-二硝基苯酚的负载与缓释

杨 慧,樊艳叶,赵佩莹,黄红梨,钟旋铭,林日辉,*,廖安平

(1.广西民族大学化学化工学院,广西多糖材料与改性重点实验室培育基地, 广西高校化学与生物转化过程新技术重点实验室,广西南宁 530006; 2.广西民族大学相思湖学院,广西南宁 530006)

2,4-二硝基苯酚(DNP)是一种典型的线粒体氧化磷酸化解偶联剂[1-2],20世纪30年代DNP作为一种减肥药物在美国广泛使用[3],1932～1938年期间的临床研究显示，服用DNP的患者出现了一系列副作用,包括白内障、胃肠道系统、心肺呼吸系统及其他类型的并发症,甚至死亡[4]。因此,1938年DNP被美国食品和药物管理局禁止使用[3,5]。但2001年,De Felice等[1]研究发现低浓度的DNP能阻止β-淀粉样蛋白肽的聚集,对神经退行性病变具有一定治疗作用,相对较高的剂量(35 mg/kg)下才会出现毒副作用,使DNP被重新关注。随后的研究发现,低剂量的DNP(3～5 mg/kg)可使代谢率提高40%,同时对损伤的神经具有良好的修复作用,不会产生不良反应[6];超低剂量的DNP(0.5 mg/kg)下可以提高学习能力,且无任何副作用[4]。Qian等[7]发现利用低浓度DNP在小鼠肝细胞中产生温和的解偶联作用,可下调肥胖小鼠的糖尿病和脂肪肝基因。近年来的临床前数据也显示,低剂量的DNP可治疗阿尔茨海默症[8-9]、帕金森病[6,9]、癫痫[4,6]、视神经炎[10]、脊髓挫伤后继发性损伤[11]和脑缺血性组织损伤[12]。但DNP是一种极性小分子,可以迅速被人体吸收,造成血药浓度急剧升高引起副作用。因此,开发一种可缓慢释放的口服DNP[6]药物制剂具有重要意义。

淀粉作为天然高分子材料在医药领域的应用受到广泛关注[13],其中微孔淀粉是一种新型的变性淀粉,由于其特殊的孔状结构,微孔淀粉吸附和缓释等性能优良[14],因此研发以微孔淀粉为载体的新型缓控释药物制剂具有广阔的市场前景。本文以α-淀粉酶水解玉米淀粉制备的微孔淀粉作为DNP缓释的载体,考察DNP在微孔淀粉上的吸附特征及DNP-微孔淀粉的缓释性能,探索DNP在微孔淀粉上的负载/释放作用方式及机理,为DNP的临床应用提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米淀粉(食品级) 广西南宁旺蜀商贸有限责任公司;α-淀粉酶(酶活2210 U/mL) BR级,美国阿拉丁;2，4-二硝基苯酚(DNP) AR级，山东西亚化学工业有限公司；胃蛋白酶 BR级,北京索莱宝;胰蛋白酶 BR级,北京索莱宝;透析袋(MW 3500) 美国雷布斯;盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠等 均为国产AR级。

L400型高速冷冻离心机 日本日立;TU1901型紫外分光光度计 北京普析仪器;WGLL-65BE型电热鼓风干燥箱 天津泰斯特;FE28型pH计 上海梅特勒;KJMR-IV型血液混匀器 江苏天翎仪器;SHY-2A型恒温水浴震荡摇床 江苏吉特实验仪器;RT10型磁力加热搅拌器 德国IKA。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米微孔淀粉的制备与表征 方祥[15]的方法,并根据实际情况做出适当调整,准确称量1.00 g玉米淀粉(直径在5～13 μm范围内,目数在1100～3000目)于150 mL锥形瓶中,依次加入50 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(50 mmol/L,pH6.4)、100 μLα-淀粉酶,在40 ℃恒温摇床(150 r/min)中反应8 h。反应完成后,用布氏漏斗抽滤,收集淀粉,用蒸馏水洗涤3次,60 ℃烘箱中烘干,粉碎,过100目筛，备用。将原淀粉和微孔淀粉制成电镜观察样品,采用场发射扫描电子显微镜(SEM)对样品表面形态表征。参考胡飞[16]的检测微孔淀粉的吸油率。

1.2.2 DNP-微孔淀粉制备条件的优化

1.2.2.1 吸附性能研究 用pH为4.5的盐酸溶液配制一定浓度(100、200、300、400、500 mg/L)的DNP溶液。将0.1 g微孔淀粉、3 mL DNP溶液加入到5 mL离心管中,将离心管放置于血液混匀器上,在恒温培养箱中于一定温度下(25、30、35、40、45 ℃)进行吸附反应(3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、90、120 min)。吸附完成后,用0.22 μm的微孔滤膜过滤,取上清液稀释相应倍数,在261 nm波长下检测吸光值[17]。由标准曲线方程(y=0.0483x-0.0348,R2=0.9995)计算各样液中的药物浓度Ce,并按式(1)计算微孔淀粉对DNP的吸附量[18]。

式(1)

式中,qe:微孔淀粉对DNP的吸附量;C0:DNP初始浓度(mg/L);Ce:吸附后DNP浓度(mg/L);V:溶液体积(L);m:微孔淀粉干重(g)。

1.2.2.2 吸附模型分析 在本实验中,采用动力学模型(包括一级动力学、二级动力学和粒子内扩散动力学模型)对吸附时间为3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、90、120 min的吸附量(DNP初始浓度为100、300、500 mg/L)实验数据进行拟合分析;利用热力学模型对吸附温度为25、30、35、40、45 ℃的吸附量实验(DNP初始浓度为100、300、500 mg/L)数据进行拟合分析。吸附常用的动力学及热力学模型[18-19]见表1。

表1 吸附动力学及热力学模型Table 1 Adsorption kinetics and model thermodynamic model

1.2.3 DNP-微孔淀粉的制备 参考赵建明[20]的方法，并根据实验情况和实际情况作出适当修改。准确称量0.1 g微孔淀粉于5 mL离心管中,加入3 mL一定浓度的DNP溶液,将离心管放置于血液混匀器上,30 ℃恒温吸附反应1 h。吸附完成后将吸附溶液用布氏漏斗抽滤,收集淀粉于60 ℃烘干,得到一定吸附量即载药量的DNP-微孔淀粉，以备缓释实验使用。

1.2.5 体外模拟缓释 根据《中国药典》[21]和李婷婷等[20]方法配制模拟体液,分别以500 mL pH1.2的模拟胃液(稀盐酸溶液,含胃蛋白酶)和pH6.8的模拟肠液(磷酸缓冲液,含胰蛋白酶)为释放介质,精确称取0.5 g的DNP-微孔淀粉(载药量为3.3085 mg/g)/原料药溶液,加入5 mL相应介质装入透析袋,于转速100 r/min、(37±0.5) ℃悬浮释放。分别于1、2、3、4、6、8、10、12和24 h取释放介质5 mL(同时补充同温等量相应介质),根据式(2)计算累计释药百分率Mt(%)。

式(2)

式中,Ci:第i次置换时释放液中的DNP浓度(mg/L);D:DNP载药量(mg/g);mdrug:DNP-微孔淀粉的质量(g);n:置换介质的次数;Ve:释放介质置换体积(L);V0:起始释放液体积(L)。

1.2.6 体外缓释动力学分析 药物体外释药模型的建立是缓释药物体外质量评价的重点。本文分别采用零级动力学、一级动力学、Higuchi及Peppas方程[14,21]对DNP-微孔淀粉的释药数据进行拟合分析。体外释放动力学模型方程见表2。

表2 药物体外释放动力学模型Table 2 Kinetic model of drug release in vitro

1.3 数据处理

所有实验均进行三次重复,采用Excel 2010进行实验数据统计,采用Origin(Pro 9.0)软件对实验参数和结果进行拟合分析及作图。

2 结果与分析

2.1 微孔淀粉的形貌及特性分析

玉米淀粉经α-淀粉酶催化水解8 h得到微孔淀粉如图1所示。与原淀粉相比,微孔淀粉的表面布满了细密的小孔,即玉米淀粉经α-淀粉酶水解后产生了孔洞,孔径范围在0.8～1.5 μm。且微孔淀粉颗粒仍保持了原淀粉颗粒的不规则菱形结构。原淀粉的吸油率为80.08%,微孔淀粉的吸油率为170.33%,比原淀粉提高112.71%。所以可以作为吸附载体进行药物缓释。

图1 电镜分析图Fig.1 Electron micrograph analysis注：A:原玉米淀粉500×;B:微孔淀粉500×。

2.2 DNP微孔淀粉制备条件的优化

2.2.1 吸附时间对微孔淀粉吸附DNP的影响及吸附动力学模型分析 为确定微孔淀粉吸附DNP的最佳吸附平衡时间,本文研究了吸附时间对微孔淀粉吸附DNP的影响,结果如图2所示,在吸附时间在3～120 min范围内,DNP初始浓度为100、300、500 mg/L,微孔淀粉对DNP的吸附呈相同趋势。在DNP初始为300 mg/L时,在0～60 min吸附量迅速增加,吸附时间为60 min时,吸附量为2.4865 mg/g,60～120 min内吸附量仅增加0.8328%,所以,将60 min设定为为最佳吸附平衡时间。

吸附动力学模型常被用于描述吸附过程中吸附质在吸附剂上的吸附速率[19]。在本实验中,采用一级动力学,二级动力学和粒子内扩散动力学模型对实验数据进行拟合分析。结果如表3所示:二级动力学模型拟合结果R2>0.99,与一级动力学和粒子内扩散模型相比R2更接近1。且二级动力学拟合出的理论计算值qe,cal(1.1766、2.5506、3.3416 mg/g)更接近实验值qe,exp(1.1594、2.4864、3.2236 mg/g)。所以,二级动力学模型更适用于描述微孔淀粉对DNP的吸附过程。说明微孔淀粉对DNP的吸附过程中不仅是物理吸附,而且可能有氢键等共同作用[22]。

表3 吸附动力学模型参数Table 3 Adsorption kinetic model parameters

2.2.2 吸附温度对微孔淀粉吸附DNP的影响及吸附热力学模型分析 吸附温度对微孔淀粉吸附DNP的影响如图3所示,在吸附温度范围内(25、30、35、40、45 ℃),微孔淀粉对DNP的吸附量随温度升高而降低。当吸附温度由25 ℃提高到45 ℃,DNP初始浓度为100、300、500 mg/L的吸附量分别降低26.79%、24.22%、26.14%。可初步确定微孔淀粉对DNP的过程是放热过程,降低温度利于吸附量的提高。

图3 反应温度对吸附过程的影响Fig.3 Effect of temperature on the adsorption process

吸附热力学模型常被用于分析温度对吸附过程的影响,将吸附数据进行热力学模型的拟合,结果见表4。在微孔淀粉吸附DNP的过程中ΔG0<0[23],表明该吸附是自发行为,且随着温度的降低|ΔG0|增大,表明降温有利于吸附进行;随着DNP浓度的升高,|ΔG0|逐渐减小,说明随着吸附量的增加,吸附位点减少,吸附的驱动力减弱。韩双艳等[24]曾报道ΔG0值在-20～0 kJ/mol之间的吸附过程为物理吸附。ΔS0<0[23,25]表明DNP被吸附到微孔淀粉上比在溶液中运动受到更大的限制,表明DNP在微孔淀粉上的排列更加紧密、有序。同时也说明焓变是此吸附过程中的主要驱动力。-10 kJ/mol<ΔH0<-7 kJ/mol,说明此吸附过程为放热过程,与温度对微孔淀粉吸附DNP的吸附量的影响结论一致。王龙等[25]认为|ΔH0|在0～29 kJ/mol和0～40 kJ/mol的吸附作用力分别为范德华力(包括色散力、诱导力及取向力)和氢键力。所以微孔淀粉对DNP的吸附为范德华力和弱氢键力共同作用的表面物理吸附。

表4 热力学参数Table 4 Thermodynamic parameters

2.2.3 DNP的初始浓度对微孔淀粉吸附DNP的影响 DNP的初始浓度对微孔淀粉吸附DNP吸附量的影响趋势如图4所示。微孔淀粉对DNP的吸附量随着DNP浓度(100～500 mg/L)的增加而增加。吸附温度为45 ℃时,DNP的初始浓度为500、100 mg/L时吸附量分别为2.5383、1.0269 mg/g,吸附量提高了147.18%。在吸附时间为1 h、吸附温度为25 ℃、DNP的初始浓度为500 mg/L时,微孔淀粉对DNP的最大吸附容量为3.4369 mg/g。

图4 DNP初始浓度对吸附过程的影响Fig.4 Effect of initial concentration of DNP on adsorption process

2.3 DNP-微孔淀粉的吸附量

因实验条件限制，本文缓释实验中所用的DNP-微孔淀粉是选用DNP初始浓度为500 mg/L，吸附温度为30 ℃，吸附时间为1 h所制备吸附量即载药量为3.3085 mg/g的DNP-微孔淀粉。

2.4 体外模拟缓释结果

DNP-微孔淀粉在模拟肠液和模拟胃液的体外缓释结果如图5。

图5 体外模拟释放曲线Fig.5 In vitro simulated release profile注：A:模拟胃液,B:模拟肠液。

可以明显看出,原料药在模拟胃液中4 h完全释放,释放率为92.23%,在模拟肠液中3 h完全释放,释放率达91.38%。所以口服DNP可被迅速吸收,短时间达到高血药浓度,引起副作用。DNP-微孔淀粉在人工胃液和肠液中释放3 h释药率分别为38.58%和78.23%,可短时间内达到有效血药浓度;在4～12 h释药速率减慢,此时可维持体内有效血药浓度,且不会产生毒副作用[22]。12 h后微孔淀粉负载的DNP药物完全释放,在模拟胃液和模拟肠液中释药率分别达91.18%和89.29%。说明DNP经微孔淀粉负载后的缓释性能明显。

2.5 体外缓释动力学分析

分别以模拟肠液和模拟胃液为释药介质进行DNP-微孔淀粉体外缓释试验,用药物释放零级方程、一级方程、Higuchi方程和Peppas方程对释药率进行动力学模型拟合,得出各拟合动力学方程,以判断释放机制,结果见表5。在模拟胃液中的缓释数据显示,一级释放动力学方程拟合的相关性(R2=0.9902)优于零级(R2=0.9680)、Higuchi(R2=0.9868)和Peppas(R2=0.9898)方程,说明一级释放动力学方程更接近实验值,能更好地描述DNP在人工模拟胃液中的累积释放量与时间的关系;在模拟肠液中的缓释结果显示，相比零级动力学(R2=0.7545)、一级释放动力学(R2=0.9212)和Higuchi(R2=0.8948)方程，更适合用Peppas动力学方程(R2=0.9525)描述DNP在人工模拟肠液中的累积释放量与时间的关系。Peppas方程中B为扩散指数,能够用来解释载药微球的释药机制,当B<0.43时,药物释放以Fickian扩散为主,当0.430.85时,药物释放以溶蚀为主[26]。在模拟肠液中的缓释B为0.2124,小于0.43,即DNP的释放以Fickian扩散为主[27];在模拟胃液中的缓释B为0.7461,0.43

表5 DNP-微孔淀粉体外释放动力学方程Table 5 In vitro release kinetics equation of DNP microporous starch

3 结论

利用α-淀粉酶水解玉米淀粉制备出了微孔淀粉。以微孔淀粉为载体对DNP进行吸附,吸附时间为1 h后达到吸附平衡,降低吸附温度或增加DNP的初始浓度能有效提高DNP负载量。当吸附温度为25 ℃、DNP的初始浓度为500 mg/L、吸附时间为1 h时,微孔淀粉对DNP的最大吸附容量为3.4369 mg/g。动力学及热力学模型拟合结果表明，微孔淀粉对DNP的吸附过程是范德华力和氢键力共同作用的表面物理吸附。其中动力学模型显示，此吸附过程符合二级动力学模型,热力学参数ΔG0、ΔS0、ΔH0表明微孔淀粉对DNP的吸附过程是可自发进行的放热过程,焓变是主要驱动力。体外缓释实验中,DNP-微孔淀粉在12 h后DNP才能释放完全,在模拟胃液和模拟肠液的释药率分别为91.18%和89.29%,与原料药相比DNP-微孔淀粉具有良好缓释作用。在缓释动力学拟合中,DNP-微孔淀粉在人工模拟胃液中的缓释行为更适合用一级动力学模型来描述,为非Fickian扩散为主(即药物通过扩散和溶蚀协同作用释药);在模拟肠液中的缓释数据更符合Peppas方程,遵循Fickian的扩散机理。因此,利用微孔淀粉作为载体对DNP进行缓释,将为降低口服DNP的毒副作用提供理论方案,对临床上DNP应用于神经损伤性疾病及神经退行性病变的治疗方面起到积极的推动作用。