不同乳酸菌复配发酵石榴汁的品质指标分析

刘晓翠,殷晓翠,马 嫄,*,刘 斌,梁智林,苏 凡, 罗 鸣,车振明,袁乙平,罗才琴,徐 娟

(1.西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039; 2.四川福能源生物科技有限公司,四川成都 610031)

石榴(PunicagranatumL)属于安石榴科,是一种药食两用的植物资源,广泛分布于亚洲、非洲、美洲和欧洲南部的温带和亚热带地区[1];石榴富含多酚、黄酮、鞣质、花色苷等生物活性物质,具有抗氧化和预防癌症等多种保健作用[2-5]。以石榴为原料可以生产鲜榨石榴汁、石榴浓缩汁、果酱等产品,还能经发酵生产石榴酒、石榴醋、石榴乳酸菌饮料等,利用益生菌发酵石榴汁可以增加其营养价值[6]。将石榴汁进行发酵是石榴深加工的一条途径,具有很好的市场前景。

目前,国内外果蔬及其制品发酵采用的益生菌以乳酸菌为主,已应用于以葡萄、苹果、胡萝卜、番茄、荔枝、蓝莓为原料的果蔬汁发酵中,常用的有植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母等[7-10]。Valero-Cases等[7]研究发现乳酸菌发酵提高了石榴汁中的酚类物质的生物利用率;Di Cagno等[8]研究发现乳酸菌发酵可以增加石榴汁的风味物质含量和种类;Ordoudi等[9]研究发现石榴汁经酒精发酵和醋酸发酵可以有效地保持其功能性成分。国内对石榴的乳酸菌发酵研究的相对较少,古小露等[10]研究发现不同发酵剂复配能较好地保持全石榴汁的抗氧化活性和营养品质;兰永丽[11]研究发现石榴汁经乳酸菌发酵后仍具有较高的多酚含量和抗氧化活性。以往研究果蔬汁发酵期间的品质变化时,为了全面反映品质变化,需要测定和分析的品质指标较多,而各指标间相互关系复杂,有的具有相关性,反映的信息有重叠部分。因此,研究反映石榴汁发酵过程中的综合品质的主要因子具有重要意义。

主成分分析法(Principal component analysis,PCA)是将多个变量通过线性变化降维,整合成较少个数的重要变量尽可能多地反映原有变量的信息的一种多元统计分析方法[12-13]。该方法侧重于客观数据,避免人为赋予权重的主观随意性,近年来在生物性状分析和产品品质分析中应用广泛[13]。将多元统计方法运用到不同乳酸菌复配发酵高品质石榴汁的比较研究未见报道。本研究以石榴汁为原料,采用先进的高纯度冻干直投式乳酸菌两两混合发酵,基于主成分分析法研究不同乳酸菌复配对发酵石榴汁品质的影响,旨在优选适合石榴汁的发酵剂复配方案,为石榴系列饮品的开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜石榴浓缩汁 由四川福能源生物科技有限公司生产;植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌发酵剂(活菌数≥1.0×1010CFU/g) 购于四川高福记生物科技有限公司;葡萄酒果酒专用酵母(活菌数≥1.0×107CFU/g) 购于安琪酵母股份有限公司；甲醇、没食子酸、福林酚试剂等 分析纯试剂,购自成都科龙化工试剂公司;Trolox(维生素E衍生物)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH) 购于上海源叶生物科技有限公司。

UV-2600型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;G154DWS型高温灭菌锅 上海赛海洋生物科技实业有限公司;A610型全自动折光仪 济南海能股份有限公司;PHS-320型pH计 成都世纪方舟科技有限公司;T50型自动电位滴定仪 台湾ELJINTEK;HH-S4型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵石榴汁的制备

首先甜石榴浓缩汁与饮用水按照1∶3.6875的质量比进行复原;将复原后的石榴汁进行65 ℃、20 min的巴氏灭菌后装入经121 ℃、20 min高温灭菌的发酵罐;加入12%质量分数为50%的白砂糖糖液;将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌两两组合(植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌编号为R2,植物乳杆菌+干酪乳杆菌编号为R3,植物乳杆菌+鼠李糖乳杆菌编号为R4,嗜酸乳杆菌+干酪乳杆菌编号为R5,嗜酸乳杆菌+鼠李糖乳杆菌编号为R6,干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌编号为R7);嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的接种量为石榴汁和糖液的总质量的1.5%,将发酵罐置于暗处,25 ℃避光发酵18 d,每隔 3 d 取样测定相关指标,自然发酵编号为R1。

1.2.2 指标测定方法 pH的测定:采用pH计测定;TSS的测定:参照Zou等[14]的方法使用阿贝折射仪测定,以蒸馏水作为空白,结果以百分含量(%)计;TA的测定:参照Varela-Santos等[15]的方法采用pH电位法测定可滴定酸,模式选择pH8.1;总酚含量的测定:参照Kwaw等[16]的方法,采用Folin-Ciocalteau法测定;花色苷含量的测定:参照Chen等[17]的方法,采用pH示差法测定;DPPH自由基清除率的测定:参照古小露等[10]的方法;抗坏血酸含量的测定:参照古小露等[10]的方法采用2,6-二氯靛酚滴定法进行测定。

1.3 数据处理

采用SPSS 23.0数据处理软件系统进行差异显著性分析和主成分分析,采用Origin 8.6软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 品质分析

2.1.1 石榴汁发酵过程中总酚含量的变化 石榴汁中的总酚是其重要的功能性成分,具有抗氧化作用,总酚含量越高，石榴汁的抗氧化作用越强[17]。由图1可知,随着发酵时间延长,各组石榴汁的总酚含量呈先上升后下降的趋势。上升可能是由于乳酸菌代谢过程中产生酚酸酯酶等酶类,这些酶能释放石榴汁中的酚类物质,测得的含量增加[18];总酚含量的下降与酚类物质的分解有关,一是由于乳酸菌在发酵过程中的应激反应而对酚类物质进行的生物代谢[18],二是花青素等黄酮类物质含量减少也会引起总酚含量的降低[11]。与自然发酵相比,乳酸菌复配可使石榴汁中的总酚保持在较高水平。发酵初期石榴汁中的总酚为81.8 mg/100 mL,发酵结束时自然发酵R1的总酚含量为63.0 mg/100 mL,降低了23.0%;R2～R7组石榴汁的总酚含量分别为75.9、70.8、71.3、72.7、73.9、69.4 mg/100 mL,其中R2组在发酵18 d后,总酚含量保持在75.9 mg/100 mL,与初始总酚含量相比,仅下降了7.2%。故植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌复配适合于石榴汁发酵。

图1 发酵期间发酵石榴汁中总酚含量的变化Fig.1 Total phenols variation of fermented pomegranate juice during fermentation

2.1.2 石榴汁发酵过程中花色苷含量的变化 石榴汁中的花色苷是其呈色物质和功能性成分,大部分以单体形式存在,主要有矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-glu)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(Pg-3-glu)和矢车菊素-3-芸香苷(Pg-3-rut)3种[19]。由图2可知,各组石榴汁的花色苷含量随时间延长而减少。发酵环境中较高的氧气含量和微生物的代谢使花色苷发生氧化降解[10];发酵期间花青素的聚合和降解反应以及花色苷与其他酚类物质的相互作用也造成花色苷含量减少[11]。与自然发酵相比,乳酸菌复合发酵可减缓花色苷的降解速度。未发酵石榴汁的花色苷含量为61.87 mg/L,发酵结束时R1的花色苷含量为30.18 mg/L,减少了51.22%,R2～R7组石榴汁的花色苷含量分别为42.38、40.51、39.82、39.75、39.78、39.28 mg/L,R2组石榴汁花色苷含量高于其余处理组。故采用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌复配发酵石榴汁效果更佳。

图2 发酵期间发酵石榴汁中花色苷含量的变化Fig.2 Anthocyanins variation of fermented pomegranate juice during fermentation

2.1.3 石榴汁发酵过程中抗坏血酸含量的变化 由图3可知,在发酵过程中各组样品的抗坏血酸含量呈现下降趋势,可见长时间发酵不利于石榴汁品质的保持。发酵结束时,自然发酵组R1的抗坏血酸含量为0.044 mg/mL,下降了58.5%,乳酸菌复配组样品的抗坏血酸含量高于R1组,可能是乳酸菌发酵过程中产生乳酸,形成的酸性环境有利于抗坏血酸的稳定[10]。发酵18 d后,R2～R7组石榴汁的抗坏血酸含量分别为0.066、0.060、0.052、0.053、0.057、0.056 mg/mL,其中R2组抗坏血酸含量保持在0.066 mg/mL,高于其余发酵组,即采用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌复配适合于石榴汁的发酵。

图3 发酵期间发酵石榴汁中抗坏血酸含量的变化Fig.3 Ascorbic acid variation of fermented pomegranate juice during fermentation

2.1.4 石榴汁发酵过程中抗氧化活性的变化 本研究选用了DPPH清除能力的方法来评价发酵过程中石榴汁抗氧化活性的变化。由图4可知,发酵期间各组石榴汁中的DPPH自由基清除率随发酵时间延长呈现先升后降的趋势。这与古小露等[10]研究益生菌发酵全石榴汁时的抗氧化品质变化趋势一致。DPPH自由基清除率与总酚含量密切相关,酚类物质经过乳酸菌发酵后分解成小分子鞣花酸后能增加其生物利用率,提高抗氧化活性[6,10]。发酵前3 d，各组石榴汁的抗氧化活性均有小幅上升。发酵中后期,抗氧化性均呈现下降趋势,这与总酚、花色苷和抗坏血酸的变化趋势一致。乳酸菌复配发酵可减缓DPPH自由基清除率的降低,发酵后R1的DPPH自由基清除率下降了45.92%,R2～R7组石榴汁的DPPH自由基清除率分别下降了21.60%、25.67%、27.26%、28.48%、29.62%、32.95%,说明植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌复配发酵石榴汁可有效保持其抗氧化功能。

图4 发酵期间发酵石榴汁中抗氧化活性的变化Fig.4 Antioxidant activity variation of fermented pomegranate juice during fermentation

2.1.5 石榴汁发酵过程中pH的变化 由图5可知,发酵期间各组石榴汁的pH呈下降趋势,其中乳酸菌复配组R2～R7的pH下降比自然发酵R1快。说明在发酵过程中乳酸菌利用石榴汁中的糖类进行糖代谢作用产生大量乳酸,使得石榴汁pH降低[10,20];发酵后期,当环境中pH达到3.5时乳酸菌可持续进行慢速乳酸发酵,当乳酸量多抑制乳酸菌代谢活动,此时pH下降变缓[21]。其中R2组石榴汁的pH下降最快,表明植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌可以更快速地代谢产生乳酸。

图5 发酵期间发酵石榴汁中pH的变化Fig.5 pH variation of fermented pomegranate juice during fermentation

2.1.6 石榴汁发酵过程中TSS的变化 石榴汁中TSS主要由果糖和葡萄糖组成[10]。由图6可知,随着发酵时间延长各组石榴汁中的TSS呈下降趋势,且R2～R7组乳酸菌复配组的TSS下降速度大于R1组。即乳酸菌利用石榴汁中的糖类进行代谢可以促进TSS的分解,提高TSS的转化利用率[10]。在发酵后期随着糖代谢产生的乳酸积累使得pH降低,进而抑制乳酸菌的代谢活动使得糖转化率降低,TSS下降趋势减缓。R2组石榴汁的TSS(4.63%)低于其余处理组,即植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌糖代谢速率较快,这与pH变化相符。

图6 发酵期间发酵石榴汁中TSS的变化Fig.6 TSS variation of fermented pomegranate juice during fermentation

2.1.7 石榴汁发酵过程中TA的变化 由图7可知,发酵期间各组石榴汁的TA呈上升趋势,且乳酸菌发酵组的TA增加速度大于R1组。石榴汁中主要的TA是有机酸,如柠檬酸、乳酸、苹果酸等,是发酵石榴汁主要的呈味物质之一,对其感官品质有重要影响[10-11]。研究表明柠檬酸和苹果酸在石榴汁发酵过程中变化不大[22],而乳酸菌发酵过程中产生乳酸,使得TA含量逐渐增加,因此乳酸菌发酵比自然发酵能增加更多的TA含量。

图7 发酵期间发酵石榴汁中TA的变化Fig.7 TA variation of fermented pomegranate juice during fermentation

2.2 相关性分析

对石榴发酵汁的各项指标进行相关性分析,结果见表1。发酵石榴汁的总酚、抗坏血酸和花色苷含量均与DPPH自由基清除率的变化呈显著正相关(P<0.01或P<0.05),TA与pH、TA与TSS呈极显著负相关(P<0.01)。由此可知,通过总酚、抗坏血酸和花色苷的含量可以判定其DPPH自由基清除率大小,评价其抗氧化活性;通过pH和TSS的变化趋势判断TA的变化情况。

表1 石榴发酵汁各项指标的相关性分析Table 1 Correlation analysis of different indexes of fermented pomegranate juice

2.3 发酵石榴汁品质指标的主成分分析

由于石榴汁在发酵期间测定的品质指标存在不同程度的差异,若只进行单一理化指标的比较,很难对各处理的石榴汁品质做出正确、客观的评价,故需要对不同乳酸菌发酵的石榴汁品质作进一步的综合评价。

2.3.1 数据标准化处理 由于各指标具有不同的量纲,在数量级上也有很大差异,在应用主成分分析研究时,不同的量纲和数量级会导致分析结果的严重偏差。数据标准化的主要功能就是将各指标数据转化成均值为0,标准差为1的无量纲数据,消除变量间的量纲关系,从而使数据具有可比性[12-13]。因此,需要对测定的所有指标数据先进行标准化处理,标准化公式为:

Xij=(Yij-Yj)/Sj

式(1)

式中:Yj和Sj分别是第 j 指标数据的平均值和标准差,经标准化后的数据仍然用X1～X7表示,将发酵期间石榴汁各项指标测定结果进行标准化处理后的数据见表2。

表2 发酵期间石榴汁各指标的标准化处理结果Table 2 Standardization results of pomegranate juice quality indicators during fermentation

续表

2.3.2 主成分的选取 将各组发酵石榴汁7个已经标准化处理的品质指标转化为7个主成分,再利用SPSS23.0软件进行主成分分析得到特征值和贡献率,结果见表3。在主成分分析中,方差代表性状在主成分方向上的分散程度,方差越大,主成分在样本数据分析中的作用越大,因此主成分的特征值和贡献率是选择主成分的重要依据[12]。实际应用中,主成分个数选择标准是能够反映原有变量的85%以上数据为依据,当累积方差贡献率大于等于85%时确定主成分的个数[13]。

表3 主成分的特征值、方差贡献率和累积方差贡献率Table 3 Eigenvalues,contribution and cumulative contribution for principal components

由表3可知,在所有主成分构成中,信息主要集中在第一个主成分,各组第一个主成分的贡献率均超过85%,其中R1处理组第一个组分的累积贡献率高达94.51%,已能反映出石榴汁在发酵过程中品质变化85%以上的信息,由此可知第一主成分能说明发酵石榴汁品质的变化趋势,符合主成分分析的要求,故选取第一主成分作为石榴发酵汁7个品质指标选择的有效成分。

表4为发酵石榴汁品质指标的主成分载荷矩阵,表5为各组指标主成分的特征向量,二者可反映各个指标对发酵石榴汁品质的影响程度。由表4、表5可知,各个组分特征向量值有其统一性,表明浓缩石榴汁在发酵期间品质变化趋势相似。对第一主成分产生正向影响的品质指标有总酚、抗坏血酸、花色苷、DPPH自由基清除率、pH、TSS。其中抗坏血酸含量X2、花色苷含量X3、DPPH清除率X4、pH X6、TSS 含量X7均为正系数值,且数值较大,说明对发酵石榴汁品质的正向影响较大,其分量值越大,发酵石榴汁的品质越好。对第一主成分产生负向影响的理化指标有X5(TA),其数值分别为-0.961、-0.934、-0.949、-0.982、-0.919、-0.960、-0.925。当主成分1较大时,正向影响最大,其中抗坏血酸X2、花色苷X3、DPPH清除率X4等都属于抗氧化活性物质,因此,第一主成分大的发酵石榴汁具有更高的抗氧化特性。

表4 各组品质指标的主成分载荷矩阵Table 4 Principal component loading matrix of each group’s indicators

表5 各组指标主成分的特征向量Table 5 Principal component eigenvectors of each group’s indicators

2.4 综合评价模型的构建

由上述可知,选取的主成分已经基本保留了所有指标的原有信息,因此选用变量Z1代替原有的7个生理指标对不同乳酸菌发酵处理的石榴汁品质进行综合评价,得出线性组合见表6(其中X1～X7均为标准化的变量)。

表6 各组发酵石榴汁品质的综合向量Table 6 Integrated eigenvectors of each group’s quality

以各处理的第一主成分对应的方差贡献率α1为权重,以Z1作为特征向量因子,构建其综合评价模型可得:F=α1Z1(2)。式中F值越大,表明发酵石榴汁的品质越好。各组石榴汁在发酵期间的品质综合得分计算结果见图8。

图8 石榴汁发酵期间品质综合得分Fig.8 Comprehensive evaluation of fermented pomegranate juice during fermentation

由图8所示,随着发酵时间的延长,各组发酵石榴汁品质得分呈现下降的趋势,与发酵过程中总酚、花色苷、抗坏血酸、DPPH自由基清除率的变化趋势一致,说明随着发酵时间延长其氧化活性减弱,但与自然发酵R1组相比,添加复配乳酸菌进行发酵可以有效减缓石榴汁中抗氧化活性物质的损失,使石榴发酵汁中的总酚、花色苷、抗坏血酸等成分维持在相对较高的水平。发酵9 d时,各组的品质综合得分均为负值,说明发酵石榴汁的品质较低,不适合再延长发酵时间。发酵结束时,R1得分已降至-3.70,此时的发酵石榴汁营养价值较低,而乳酸菌发酵组的石榴汁得分相对较高。6个乳酸菌发酵组之间品质得分无显著差异(P>0.05),其中R2组发酵石榴汁中总酚、抗坏血酸和花色苷含量高于其余的处理组,即植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌复配发酵的石榴汁品质更佳。

3 结论

研究发现,接种不同复配乳酸菌发酵的石榴汁具有独特的乳酸风味,具有较高的抗氧化能力和营养品质。与自然发酵相比,添加乳酸菌进行发酵能提高TSS的转化利用率,促进乳酸产生,降低pH,使石榴汁的TA含量增加。发酵期间,各组石榴汁的总酚、抗坏血酸、花色苷等活性成分整体呈下降趋势,而乳酸菌复配发酵可使石榴汁的抗氧化活性维持在较高水平,其中植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌复配发酵能使石榴汁的TSS降到4.63%,TA含量增加到0.88 mg/mL,使发酵石榴汁的总酚、抗坏血酸、花色苷和DPPH自由基清除率分别保持在75.9 mg/100 mL、0.066 mg/mL、42.38 mg/L和66.43%。通过相关性分析发现石榴汁中的抗氧化活性与总酚、花色苷和抗坏血酸含量呈显著正相关(P<0.01),TA与pH和TSS呈显著负相关(P<0.01)。

综上所述,与自然发酵相比,乳酸菌复配发酵的石榴汁的总酚、花色苷、抗坏血酸和抗氧化等品质更佳,且植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌复配组对石榴汁的抗氧化品质保持效果最佳,适合用于石榴汁发酵,为石榴产品的精深加工提供一定的参考依据。