两种Amadori衍生物的合成及其热降解产物研究

张士怡,李 瑞,张豫丹,来 苗,赵铭钦

(河南农业大学烟草学院,河南郑州 450002)

Amadori化合物是美拉德反应中起关键作用的中间产物,它是由氨基酸和还原糖缩合进而发生分子重排形成的[1-2]。Amadori化合物广泛存在于面包[3-4]、肉类[5]、咖啡以及烟草[6-10]等的制造和储存过程中,对食品的色泽、风味和营养价值起着重要作用。国内外很多学者对Amadori化合物热裂解过程的研究表明,Amadori化合物可作为一类重要香味前体物质[11-13]。对于Amadori化合物的研究仍存在以下问题:一是Amadori化合物的合成较难,分离过程需要多次过柱子纯化,产率低,导致纯品Amadori化合物价格偏高;二是缺乏有效调控Amadori化合物降解产物的方法。目前调控Amadori化合物降解产物的方法主要采用改变反应的外界条件比如温度、pH、反应时间以及含水量等方式实现。比如Hofmann等[14]研究表明1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖在有氧条件下生成的苯乙醛的含量较高;Martins等[15]通过在线热裂解气质对1-L-甘氨酸-1-脱氧-D-果糖的热裂解研究表明,pH对部分裂解产物有影响。Amadori化合物热降解产物难以调控的主要原因是Amadori化合物为活泼中间体,可通过1,2-烯醇化、2,3-烯醇化、重排、Strecker降解等多种途径降解[16-18]。因此,开发基于Amadori化合物的衍生物,尤其是易合成且热降解产物可调控的衍生物,具有广阔的应用前景。

本研究以廉价果糖为原料,通过羟醛缩合、磺酸化等反应合成两种Amadori衍生物[19-20]:二-O-异亚丙基-2,3:4,5-β-D-吡喃果糖基苯丙氨酸酯(PDFD)和二-O-异亚丙基-2,3:4,5-β-D-吡喃果糖基酪氨酸酯(TDFD)。与1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖和1-L-酪氨酸-1-脱氧-D-果糖相比,PDFD和TDFD糖环上的活泼羟基由异亚丙基保护,从而降低糖环的反应活性,一定程度上抑制其重排、失水等降解反应[21]。文章通过热重(Thermogravimetry-differential thermogravimetry,TG-DTG)和差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)测定两种衍生物的热失重和热降解温度。并进一步利用在线热裂解-气质(Pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry,Py-GC/MS)联用技术研究两种衍生物在300、600、900 ℃条件下的热降解产物,重点分析物质作为香味前体物质的潜能，并对其热降解机理进行简要探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-果糖、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸 北京索莱宝科技有限公司;无水硫酸镁 天津市登科化学试剂有限公司;氢氧化钠 天津市大茂化学试剂厂;三氟甲磺酸酐 萨恩化学技术(上海)有限公司;2,6-二叔丁基-4-甲基吡啶 阿拉丁试剂(上海)有限公司;N,N-二异丙基乙胺 上海麦瑞尔化学技术有限公司;薄层层析硅胶 青岛海洋化工有限公司;去离子水 Millipore公司Milli-Q系统(经0.22 μm薄膜过滤器过滤,>18.2 MΩ cm)净化;浓硫酸、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇 分析级,天津市富宇精细化工有限公司。

400-MHz核磁共振仪 德国Bruker公司;Q-TOF1290LC-6540高分辨质谱仪 美国Agilent公司;STA409PC综合热分析仪 德国Netzsch公司;CDSPyroprobe5000热裂解和气质联用仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PDFD和TDFD的制备合成 PDFD和TDFD的制备合成参考文献[19]和[20],并在文献的基础上优化了部分反应条件(图1)。保护果糖吡喃糖环上的羟基有利于C1′位羟基经磺酸化后与氨基酸酯发生亲核取代反应而形成目标Amadori衍生物。化合物2(二-O-异亚丙基-2,3:4,5-β-D-吡喃果糖)和3(二-O-异亚丙基-2,3:4,5-β-D-吡喃果糖基三氟甲磺酸酯)的合成参考文献[19]和[20]。

图1 PDFD和TDFD的合成路线Fig.1 Synthetic route of PDFD and TDFD

1.2.2 化合物2的合成 将D-果糖(2.00 g、11.09 mmol)、丙酮(39 mL)、浓硫酸(1.94 mL、36.4 mmol)依次加入到烧瓶中,于冰水浴下搅拌4 h。通过薄层色谱法(TLC)对反应进程进行跟踪,直至混合物中D-果糖反应完全为止。展开剂为乙酸乙酯-石油醚(V/V=1∶3)。反应结束后,在反应液中加入冰NaOH溶液(5.50 mol/L,27.78 mL),用无水二氯甲烷(30 mL)萃取8次。将萃取液经无水硫酸镁干燥,过滤减压浓缩后得到淡黄色化合物2(2.20 g,产率为76%)。

1.2.3 化合物3的合成 在氮气保护条件下,于无水二氯甲烷中依次加入2,6-二叔丁基-4-甲基吡啶(523.62 mg、2.55 mmol)、三氟甲基磺酸酐(0.43 mL、2.55 mmol)和化合物2(603.11 mg、2.32 mmol),在冰水浴中反应1 h,通过薄层色谱法(TLC)对反应进程进行跟踪,直至混合物中化合物3反应完全为止。展开剂为乙酸乙酯-石油醚(V/V=1∶3)。反应结束后,在反应液中加入冰水(15 mL),用无水二氯甲烷(15 mL)萃取8次。将萃取液经无水硫酸镁干燥,过滤减压浓缩后得到粗产物。用硅胶柱对粗产物进行分离纯化,流动相为乙酸乙酯-石油醚(V/V=1∶3),最后得黄色油状化合物3(869.40 mg,产率为96%)。

1.2.4 PDFD的合成 在氮气保护的条件下,于无水二甲基甲酰胺DMF(10 mL)中依次加入化合物3(153.90 mg、0.39 mmol)、苯丙氨酸酯(113.70 mg、0.59 mmol)以及N,N-二异丙基乙胺(0.13 mL、0.78 mmol),混合物在120 ℃条件下加热回流反应6 h。通过薄层色谱法(TLC)对反应进程进行跟踪,直至混合物中化合物3反应完全为止。展开剂为乙酸乙酯-石油醚(V/V=1∶3)。反应结束后减压浓缩反应液,用硅胶柱对粗产物进行分离纯化,流动相为乙酸乙酯-石油醚(V/V=1∶3),最后得橘黄色油状化合物PDFD(139.10 mg,产率为82%)。

1.2.5 TDFD的合成 在氮气保护的条件下,于无水二甲基甲酰胺DMF(10 mL)中依次加入化合物3(179.88 mg、0.46 mmol)、酪氨酸酯(143.80 mg、0.69 mmol)以及N,N-二异丙基乙胺(0.15 mL、0.92 mmol),混合物在120 ℃条件下加热回流反应6 h。通过薄层色谱法(TLC)对反应进程进行监控,展开剂为乙酸乙酯-石油醚(V/V=2∶1)。反应结束后减压浓缩反应液,用硅胶柱对粗产物进行分离纯化,流动相为乙酸乙酯-石油醚(V/V=2∶1),最后得橘黄色油状化合物TDFD(151.20 mg,产率为73%)。

1.3 分析方法

1.3.1 化合物结构鉴定1H NMR和13C NMR谱图是在Brucker 400-MHz核磁共振仪上测得的。将PDFD、TDFD分别溶于含有四甲基硅烷(TMS)作内标的氘代氯仿(CDCl3)中进行测定。高分辨质谱是在郑州大学分析测试中心测得,所用仪器型号为Q-TOF1290LC-6540。

1.3.2 热分析 分别称取PDFD和TDFD约为10 mg,光谱纯Al2O3作为参照。整个测量过程在静态空气环境下(气流流速为60 mL/min)的氧化铝坩埚中进行。测试温度范围为30～900 ℃,升温速率为10 ℃/min。可同时得到样品的TG、DTG和DSC曲线。

1.3.3 在线热裂解气质联用(Py-GC/MS)分析 称取固体样品1 mg,加入中空小石英管中,两端塞入石英棉,将其置于热裂解仪的裂解头加热丝中。裂解氛围为10%氧气和90%氮气。热裂解条件和气质条件参照文献[22]设置。

热裂解条件:初始温度为40 ℃,保持1 min,以10 ℃/s的速度分别升至300、600、900 ℃保持100 s。最后在氦气的氛围中将裂解产物导入GC/MS进行分析。

气相色谱条件:DB-5MS熔融石英毛细管柱(50 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度为280 ℃;进样量为1 μL;载气选择高纯氦气(纯度99.9999%);流速为1 mL/min;升温程序为初始温度50 ℃保持2 min,然后以5 ℃/min升到280 ℃,保持20 min;分流比为25∶1;溶剂延迟时间为3.6 min。

质谱条件:电子轰击离子源(EI),离子源温度为230 ℃,电离能量为70 eV,传输线温度为280 ℃,质量扫描范围30～400 amu。

数据处理:定性分析采用气质工作站NIST10标准质谱图库检索完成,并与文献资料中图谱解析结果进行比较。定量分析利用手动积分方法,按面积归一化法计算出各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 PDFD和TDFD的结构表征

文章采用薄层层析色谱、1H NMR、13C NMR以及HRMS对PDFD和TDFD的结构进行表征,结果如图2和表1所示。薄层层析色谱结果表明PDFD和TDFD在不同展开剂条件下均呈现一个点;氢谱碳谱的结果表明氢原子、碳原子的种类个数与目标化合物一致;质谱数据也检测到目标化合物的分子峰;综上PDFD和TDFD两种物质符合预期的化学结构且纯度较高。化合物2[20]和3[19]的表征文献中已有报道。

表1 PDFD和TDFD的结构表征Table 1 Characterization of PDFD and TDFD

图2 PDFD和TDFD在不同展开剂下的薄层层析色谱图(紫外灯下显色)Fig.2 TLC results of PDFD and TDFD in different mobile phase(visualized by UV light)

2.2 PDFD和TDFD的TG-DTG分析

TG-DTG曲线反映温度变化与试样质量损失之间的关系。图3显示了PDFD的TG(%)和DTG曲线(%/min)。从PDFD在室温至900 ℃之间的温度变化曲线可以看出,其热降解过程分为两个阶段:第一阶段为145.6～340.6 ℃,质量损失98.3%,这是PDFD的主要降解阶段,在此阶段试样最大质量损失率出现在Tp为273.3 ℃,该阶段可能是由C-N键断裂脱氨造成的[23];第二阶段为340.6～900 ℃,试样的质量损失过程较慢,质量损失为1.7%,这部分可能是试样在高温下发生炭化的结果[24]。

图3 PDFD的TG-DTG曲线Fig.3 TG-DTG curves of PDFD

图4显示了TDFD的TG(%)和DTG曲线(%/min)。从图4中可看出,TDFD热降解过程分为三个阶段:初始降解阶段为60.8～183.5 ℃,质量损失13.0%,此阶段可能是样品脱水脱羧等原因造成的。第二阶段是TDFD的主要降解阶段,温度范围为183.5～413.7 ℃,质量损失为67.2%,此阶段试样最大质量损失率Tp为340.5 ℃,该阶段降解可能是由C-N键的断裂以及其它化学键的断裂引起的[23];第三阶段是413.7～900 ℃,试样的质量损失过程较慢,质量损失为9.7%。PDFD和TDFD的TG-DTG曲线表明两种试样在室温下均有较好的稳定性。

图4 TDFD的TG-DTG曲线Fig.4 TG-DTG curves of TDFD

2.3 PDFD和TDFD的DSC分析

这两种物质的DSC曲线如图5和图6所示。DSC曲线表现的是物质的热性质随温度的变化关系。两种物质均表现出由氧化降解等反应产生的放热峰。对于PDFD,峰值出现在223.1 ℃,这与TG-DTG曲线上Tp值相近;对于TDFD,峰值出现在349.3 ℃。两种物质DSC曲线在700～900 ℃出现的远离基线的峰是由同步热分析仪在测试过程中造成的[25]。TDFD与PDFD相比热降解所需温度更高,原因可能是因为TDFD苯环上羟基可通过形成氢键来增强分子间相互作用力,从而增强了TDFD的热稳定性[26]。

图5 PDFD的DSC曲线Fig.5 DSC curve of PDFD

图6 TDFD的DSC曲线Fig.6 DSC curve of TDFD

2.4 PDFD和TDFD的热降解产物分析

TG-DTG和DSC是研究有机化合物热性能的重要手段,从中可以了解物质的降解温度,但其热降解产物没有得到鉴定。而对PDFD和TDFD的热降解产物研究在卷烟加香中的应用具有重要指导意义。TG-DTG结果表明两种物质在500 ℃就已基本降解完全,但卷烟抽吸时最高温度可达873 ℃[27],考虑卷烟燃烧的实际温度情况选择在300、600和900 ℃条件下分别进行热裂解实验,其热降解产物由热裂解气质色谱联用仪(Py-GC/MS)测得,且根据NIST10标准库进行定性分析鉴定,并将主要的热降解产物列于表2。

表2 PDFD和TDFD的热降解产物Table 2 Pyrolysis products of PDFD and TDFD

续表

续表

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对PDFD和TDFD的热降解产物分析可看出,在高温下两种物质均降解出多种挥发性香味物质,按照官能团进行分类,大致可分为酮类、醛类、酯类以及呋喃类。具体而言,PDFD热降解产物中酮类物质有丙酮、2-丁酮、3-甲基丁酮、戊烷-2,3-二酮、苯乙酮等,其中2-丁酮存在于咖啡中,有飘逸的醚香和轻微果香;戊烷-2,3-二酮具有巧克力奶油香味;苯乙酮具有类似杏仁香气。醛类物质有苯甲醛、苯乙醛、2-甲基苯甲醛等,其中苯甲醛具有苦杏仁香气和焦甜味;苯乙醛具有类似风信子香气。酯类物质有乙酸乙酯、乙酸对苯甲酯、2-乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯和肉桂酸乙酯,它们分别具有果香味、百合香味、甜蜜香味、蜂蜜似花香香气和水果香气。呋喃类物质包括2-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃、2-乙基呋喃、2-乙酰基呋喃以及糠醛等,其中后三种物质均具有浓郁的焦糖似香气。TDFD热降解产物与PDFD的热降解产物种类大致类似,比如均包含丙酮、乙酸乙酯、2-乙基呋喃、2-丁酮、糠醛、2-乙酰基呋喃、3-苯丙酸乙酯等挥发性香味物质,不同的是,TDFD热降解产物中包含了一定量的酚类物质,比如邻甲基苯酚、对甲基苯酚以及苯酚等。

随温度的升高，PDFD和TDFD的热降解产物在种类和含量上均呈现出一定的变化。在300 ℃降解时,PDFD的主要降解产物为苯甲醛、3-苯丙酸乙酯、化合物2及其衍生物,含量分别为1.31%、1.25%和29.88%。在600 ℃降解时,化合物2及其衍生物的含量迅速减少至0.88%,同时伴随着酮类、醛类、呋喃类等挥发性香味物质的产生,在此温度条件下,也生成了少量的有害物质如甲苯等。当继续升温至900 ℃时,PDFD降解产生更多的香味物质，比如苯乙醛、2-乙酰基呋喃、吲哚、喹啉等。值得注意的是,与600 ℃条件下降解相比,有害物质的含量却变化不大,比如甲苯在600和900 ℃降解条件下含量分别为0.42%和0.32%。可见600 ℃及其以上温度是PDFD释放挥发性致香物质的理想温度,且温度越高,香味物质种类越多。TDFD在300 ℃条件下热降解产物种类和含量均较少,主要为酪氨酸(0.17%)和化合物2(2.85%)。600 ℃条件下,

TDFD主要降解产物为对甲基苯酚(17.00%)、化合物2(22.6%)、苯酚(7.97%)以及其它挥发性物质。其在900 ℃高温下降解产物中仍含有大量的化合物2(21.16%)未降解完全,说明TDFD热降解所需温度比PDFD高,该结论与TG-DTG热分析结果一致。

国内外很多学者研究未保护的Amadori化合物的热降解产物,其中欧亚非等[23]和芦昶彤等[29]采用在线热裂解气质联用技术研究了1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖和2-L-酪氨酸-2-脱氧-D-葡萄糖在不同温度条件下的热降解产物,结果表明各个温度条件下热降解产物种类多,包括酸类、醇类、酮类、芳烃类和杂环类(包括吡嗪类、呋喃类、吡咯类、吡啶类以及呋喃酮类),其中以芳烃类和杂环类为主要降解产物。PDFD和TDFD与未保护Amadori化合物热降解产物相比表现为:一是热降解产物种类少,杂环类降解产物中以呋喃类为主,其它类的杂环化合物均较少。比如1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖在850 ℃的热降解共鉴定出70种成分,其中呋喃类4种(4.93%)、吡嗪类5种(7.44%)、吡咯类3种(3.06%)、吡啶类5种(3.60%)、喹喔啉类1种(0.75%),而PDFD在900 ℃的热降解产物共47种,且呋喃类8种(1.16%)、吡啶2种(0.13%)、吡咯1种(0.09%)。这可能是因为吡喃糖上被保护的羟基阻碍了其它杂环化合物的形成[30]。二是热降解产物中有害物质的种类及含量也较少,比如1-L-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖在850 ℃的热降解产物中含量较大的稠环芳烃有茚类3种(3.34%)和萘类化合物6种(5.07%),而PDFD在900 ℃降解产物中几乎不含稠环芳烃。

2.5 PDFD和TDFD的热降解机理分析

热降解机理研究对PDFD和TDFD作为香料添加剂在食品高温加工中的应用具有重要意义。推测的热降解机理如图7所示。在PDFD和TDFD的热降解过程起始于果糖残基和氨基酸残基。果糖残基经过去保护、脱氨等反应形成还原酮类,进而发生分子间断裂形成小分子烯酮或烯醛,或者发生环化形成糠醛类和呋喃类化合物[31]。PDFD中氨基酸部分通过脱氨和失水产生3-苯丙酸乙酯和肉桂酸乙酯,而后经脱羧及不同位点C-C键断裂产生苯乙醛、苯乙烯、苯甲醛、2-乙酸苯乙酯等烷基苯。TDFD上酪氨酸酯部分通过脱氨、脱羧以及不同位点的C-C键断裂形成酪氨酸、3-(4-羟基苯基)丙酸甲酯,继而降解产生4-烯丙基苯酚、4-乙基苯酚、对甲基苯酚、苯酚等酚类物质。在最后的热降解过程中,氨基酸部分碳链的不同位点断裂和重排缩合生成其他化合物。

图7 PDFD和TDFD热降解机理分析Fig.7 Degradation mechanisms of PDFD and TDFD

3 结论

本实验以D-果糖、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸为原料,合成两种Amadori衍生物PDFD和TDFD,利用TLC、1H NMR、13C NMR、HRMS对产物结构进行了表征。文章通过TG-DTG、DSC以及Py-GC/MS等手段研究两种物质的热特性和热降解产物,并简要探讨了其热降解机理。TG-DTG结果表明，PDFD和TDFD主要质量损失范围分别为145.6～340.6 ℃和183.5～413.7 ℃,Tp分别为273.3 ℃和340.5 ℃。DSC结果表明，两种物质的Tpeak分别为223.1 ℃(PDFD)和349.3 ℃(TDFD),与TG-DTG结果基本一致。Py-GC/MS结果表明两种物质均可热降解产生大量的挥发性香味物质,如2-丁酮、苯乙烯、苯甲醛、3-苯丙酸乙酯、2-乙酰基呋喃、糠醛等,两者之间区别是TDFD所需热降解温度较高且热降解产物多为酚类物质。PDFD和TDFD的热降解结果与文献中报道的Amadori化合物热降解产物相比,两种衍生物产生吡咯类、吡嗪类等杂环化合物的物质较少,说明通过保护吡喃糖环上活性羟基可在一定程度上调控降解产物。该研究不仅提供一类基于Amadori化合物的新型香料前体物质,而且为调控Amadori化合物降解产物提供新思路。