蛋白氧化对秘鲁鱿鱼肌肉品质及其结构的影响

朱文慧,宦海珍,李 月,步 营,仪淑敏,励建荣,李学鹏,*,沈 琳

(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制 工程技术研究中心”,国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心,辽宁锦州 121013; 2.大连东霖食品股份有限公司,辽宁大连 116000)

水产品在冻结、冻藏、解冻过程中受许多因素(冻结方式、冻藏温度及温度波动、解冻方式等)的影响使肌肉蛋白氧化变性,导致水产品品质(质构、色泽、风味等)劣变给企业带来经济损失,同时影响消费者的健康[1-3]。研究表明,氧化是导致水产品品质变化的重要因素之一,关于水产品蛋白氧化的研究已成热点[4-8]。

秘鲁鱿鱼隶属头足纲,柔鱼科,是海生软体动物,在秘鲁和智利沿岸及外海资源丰富,资源量达千万吨。其肉质比其他鱿鱼鲜嫩,营养丰富,是典型的高蛋白低脂肪海产品[9]。秘鲁鱿鱼为远洋捕捞动物,捕捞上来需要就地冻结,因此,秘鲁鱿鱼的进出口及加工均以冻品为主。本研究组在前期研究发现,秘鲁鱿鱼在解冻过程中伴随着蛋白质氧化[10-11],蛋白氧化不仅会影响产品的滋味、嫩度、色泽、多汁性等感官品质,还会影响肌肉的组织结构和功能性质[12-13]。岳开华等[4]研究发现海鲈鱼肌原纤维蛋白经羟自由基氧化后,其结构和功能均发生显著变化,且随着氧化时间的延长和氧化剂浓度的增加,羰基含量和表面疏水性增加,二聚酪氨酸先增加后减少,总巯基含量下降,一些生色氨基酸大量减少。秦军委等[14]亦发现在冻藏过程中,羟自由基氧化使乌鳢肌原纤维遭到破坏,蛋白氧化变性,从而导致其保水性降低。

为了明晰蛋白氧化对秘鲁鱿鱼肌肉保水性以及蛋白结构的影响,本研究通过建立羟基自由基氧化体系,探讨不同H2O2浓度对秘鲁鱿鱼肌肉保水性及微观结构的影响,阐明蛋白氧化对肌肉保水性的影响规律,进一步揭示蛋白氧化对秘鲁鱿鱼肉品质影响机制,为其在贮藏加工过程中蛋白氧化控制、提高肌肉保水性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冻结秘鲁鱿鱼(捕捞后立即冻结,贮藏在-20 ℃,贮藏时间少于3个月) 大连东霖食品股份有限公司提供，密封冻藏运回实验室,快速分割成砖状,质量约300 g(长宽约15 cm×8 cm),置于-40 ℃超低温冰箱中备用；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazone,DNPH)、乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid,EDTA)、三氯乙酸、盐酸、盐酸胍(均为分析纯) 购自南京圣比奥生物科技公司；苏木素-伊红(HE) 购自北京索莱宝科技有限公司。

PHS-3C型雷磁pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;Testo 106型高精度食品温度计 德国德图集团;PL602-L电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;FJ200-SH型实验室均质机 上海标本模型厂;纽迈-NMI-20低场核磁共振仪 上海纽迈电子科技有限公司;SORVALL Stratos型冷冻高速离心机 美国Thermo公司;UV-2550紫外-可见光分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 实验以冻结的秘鲁鱿鱼胴体为研究对象。使用时,将从分装样品中随机选取的秘鲁鱿鱼置于10 ℃环境中解冻至完全,用滤纸轻轻檫干表面水分,将解冻完全的鱿鱼切分成2 cm×2 cm×2 cm的正方体,然后置于不同浓度的H2O2溶液(其中,FeCl3浓度为0.01 mmol/L、抗坏血酸浓度为0.1 mmol/L,H2O2浓度分别为1、5、10、50 mmol/L)的氧化体系中(1/4.5,W/V)模拟肌肉氧化,在4 ℃条件下氧化24 h后,最后用1 mmol/L EDTA终止。空白对照为冻结的秘鲁鱿鱼解冻完全后直接放于未加氧化剂的蒸馏水中4 ℃放置24 h。

1.2.2 鱿鱼肌原纤维蛋白的提取 依据李学鹏等[15]的方法并加以修改,将解冻氧化后的秘鲁鱿鱼肉搅碎,加入4倍体积的pH7.2、20 mmol/L的Tris-HCl,5000 r/min均质20 s,然后在5000 r/min条件下离心15 min。上述过程反复2次,最后一次沉淀中加入4倍体积的20 mmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液(含0.6 mol/L NaCl,pH=7.2),5000 r/min均质20 s,5000 r/min、离心15 min,取上层清液备用,要求整个提取过程在0～4 ℃条件下进行。

1.2.3 羰基含量测定 根据Oliver等[16]的方法略加修改。取1 mL浓度约为1.0 mg/mL氧化蛋白溶液放入离心管中,每管中加入1 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(对照组加入2 mol/L HCl,其余操作相同),室温下暗处静置1 h,加入4 mL 20%三氯乙酸,10000 r/min,4 ℃离心15 min,弃上清液,用1 mL乙酸乙酯∶乙醇 (V/V=1∶1)洗涤沉淀3次,除去未反应试剂,加入3 mL盐酸胍溶液(6 mol/L,溶于20 mmol/L 磷酸钠缓冲液,pH6.5),37 ℃下溶解沉淀25 min,10000 r/min,4 ℃离心 5 min,去除不溶性部分。所得溶液于370 nm波长下测定吸光度,摩尔吸光系数为21000 L/(mol·cm),羰基含量表示为nmol/mg蛋白(myofibrillar protein,MP)。

1.2.4 紫外吸收光谱分析 将肌原纤维蛋白溶液稀释,在4 ℃条件下,10000×g高速离心15 min。上清液用20 mmol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液(含0.6 mol/L NaCl,pH=7.2)进一步稀释至0.4 mg/mL后,测定样品在220～360 nm的吸收光谱。

1.2.5 光学显微镜观察秘鲁鱿鱼肌肉微观结构 将氧化处理后的秘鲁鱿鱼肉切成5 mm×5 mm×5 mm的小块,-20 ℃冷藏20 min,用冷冻切片机切成8 μm薄片,置于载玻片上,采用苏木素-伊红(HE)染色法染色,在光学显微镜下放大4倍观察[17]。

1.2.6 肌原纤维小片化指数(Myofibrillar flake index,MFI)的测定 根据Culler等[18]描述的方法并加以修改后进行测定。剪取5 g经氧化后的秘鲁鱿鱼肉样品充分剪切,除去任何可视脂肪和结缔组织,将剪切好的肌肉,在10倍体积的4 ℃的分离介质中(分离介质含100 mmol/L KCl、20 mmol/L磷酸钾、0.1 mmol/L EDTA、l mmol/L CaCl2溶液用HCl调pH7.0),用组织捣碎机捣碎搅匀。匀浆在1000×g离心15 min,然后缓慢倒出上层清液,沉淀又在10倍体积分离介质中,用搅捧搅拌制成悬液,在1000×g离心15 min。慢慢倒出上层清液,沉淀在2.5倍体积的分离介质中制成悬液，通过150目滤布除去结缔组织和碎片,再加2.5倍体积的分离介质来帮助肌原纤维通过筛孔。合并滤液,将滤液用双缩脲法测蛋白浓度,然后用MFI缓冲液调整悬浮液蛋白浓度为0.5 mg/mL,在540 nm处测吸光度,将所得结果乘以200,即为MFI值。

1.2.7 蒸煮损失率测定 称取一定大小(约2 cm×2 cm×2 cm)的秘鲁鱿鱼样品,记下其重量,将鱿鱼放入蒸煮袋中在85 ℃水浴锅中蒸煮20 min。蒸煮后冷却至室温,用吸水纸吸干水分,然后再次称重量,蒸煮损失率的计算公式如(1)[19]。

蒸煮损失率(%)=[蒸煮前重量(g)-蒸煮后重量(g)]/蒸煮前重量(g)×100

式(1)

1.2.8 离心损失率测定 将解冻好的鱿鱼肉准确称其质量后用滤纸将肉样包裹好,放入离心管中,于4 ℃下4000×g,离心10 min,取出样品,剥去滤纸,称肉样重[17]。

离心损失率(%)=[离心前重量(g)-离心后重量(g)]/离心前重量(g)×100

式(2)

1.2.9 低场核磁共振实验 鱿鱼样品解冻后,切成1.5 cm×1.5 cm×2 cm的长方体,转入核磁管,采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列,在32 ℃下进行横向弛豫时间T2的测定。参数设定:采样点数(TD)为560020,90度脉冲宽度为14,接收谱宽(SW)为200 kHz,采样重复时间(TR)为2000 ms,重复扫描次数(NS)为8,半回波时间(τ)为100 μs,回波个数(Echocnt)为4000。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析,采用多重比较分析法对各处理组进行差异显著性分析,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。试验结果如未特殊说明均最少为3次重复,结果均表示采用“平均值±标准偏差”。

2 结果与讨论

2.1 蛋白质氧化对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白中羰基含量的影响

蛋白质中羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白质发生氧化以后的一个显著变化。羰基可由氨基酸侧链(通常为易受自由基攻击的带有NH或者NH2的氨基酸残基)及肽链的断裂产生[20],因此羰基含量一直是反映蛋白质氧化程度的重要理化指标。

羟自由基氧化体系对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白中羰基含量的影响如图1所示,由图1可知,随着H2O2浓度的增加,羰基含量呈现逐渐上升的趋势,且与空白相比差异极显著(P<0.01)。其中空白对照组羰基含量为2.09 nmol/mg MP,当H2O2浓度达到50 mmol/L时,羰基含量增加了53.59%。羰基含量的增加可能是由于羟自由基攻击了氨基酸侧链或肽链导致的[21]。在此氧化体系中,随着H2O2浓度的增加,羟自由基浓度也随之增加,使得更多的羟基攻击氨基酸侧链或肽链,导致羰基含量不断升高,本研究与彭新颜等[22]的研究结果一致。

图1 羟自由基氧化体系对秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白中羰基含量的影响Fig.1 Effect of hydroxyl radical oxidation system on carbonyl content of Dosidicus gigas myofibrillar protein注:图中不同小写字母表示差异极显著(P<0.01), 不同大写字母表示差异显著(P<0.05),图4、图5同。

2.2 氧化对紫外吸收光谱的影响

紫外吸收光谱可以反映肌原纤维蛋白内某些生色氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的含量,被广泛地应用于评价氧化引起的蛋白结构变化[20]。羟自由基氧化对秘鲁鱿鱼的紫外吸收光谱的影响如图2所示,由图2可以看出,秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白的紫外吸收光谱的特征峰值随着H2O2浓度增加而下降。这是由于羟基会使肌原纤维蛋白中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等生色氨基酸发生氧化,使得它们的含量减少,导致秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白的紫外吸收光谱吸收峰值下降。李银[20]、岳开华等[4]的研究也有相同的结果,氧化使得肌原纤维蛋白中的酪氨酸含量显著下降,岳开华等[4]还发现蛋白质氧化导致的聚集使得生色氨基酸残基被包埋,也会导致吸收峰值下降。

图2 肌原纤维蛋白紫外吸收光谱图Fig.2 Ultraviolet and visible spectrum of myofibrillar protein

2.3 氧化对秘鲁鱿鱼微观组织结构的影响

H2O2氧化处理对秘鲁鱿鱼肌肉组织微结构的影响结果如图3所示,如图3可知,未经过氧化处理(对照组,0 mmol/L)的秘鲁鱿鱼肌肉组织呈紧密连接的网状结构且肌纤维束结构完整,缝隙均匀。经过不同浓度H2O2氧化处理后,秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白发生了氧化作用使得骨架蛋白发生降解,从而导致肌原纤维结构遭到破坏,并且肌肉微观结构的破坏程度随着氧化浓度的增加而增加。在H2O2浓度为10、50 mmol/L时,很难在显微镜下找到完整的肌纤维结构。由此可知,H2O2氧化处理能够明显破坏秘鲁鱿鱼肌肉组织结构,而组织结构劣变会降低肌肉的持水性,弱化肌肉与水的结合能力,从而产生大量的滴水损失,使得水分发生迁移,最终导致肌肉质地软化和品质下降[23,17]。

图3 羟基自由基氧化体系对秘鲁鱿鱼肌肉微观组织结构的影响(×4)Fig.3 Effects of hydroxyl radical oxidation system on the muscle microstructure of Dosidicus gigas(×4)注:A. 0 mmol/L H2O2处理组(对照组); B. 1 mmol/L H2O2处理组;C. 5 mmol/L H2O2处理组; D. 10 mmol/L H2O2处理组;E. 50 mmol/L H2O2处理组。

2.4 蛋白质氧化对肌原纤维小片化指数(MFI)的影响

肌原纤维小片化指数(MFI)反映的是肌原纤维及其骨架蛋白完整度的指标。MFI越大,说明肌原纤维内部结构的完整性受到破坏的程度越大[24-25]。羟自由基氧化体系对秘鲁鱿鱼肌原纤维小片化指数的影响如图4所示,由图4可知,经过不同氧化浓度处理后的秘鲁鱿鱼肌肉间肌原纤维小片化指数差异极显著(P<0.01),且随着氧化浓度的增加,肌原纤维小片化指数逐渐增加。在H2O2浓度为50 mmol/L时,肌原纤维小片化指数达到103,约是对照组(0 mmol/L)的1.5倍。肌原纤维小片化指数升高说明氧化使得肌原纤维和蛋白质结构的完整性遭到破坏,蛋白质变性,肌原纤维间隙变大,暴露于外界的结构接触氧的机会更多,从而加剧了小片化的速率[14]。光学显微镜下秘鲁鱿鱼肌肉微观组织结构显示H2O2浓度越高,肌原纤维结构被破坏的越严重,与肌原纤维小片化指数结果相一致。

图4 羟自由基氧化体系对秘鲁鱿鱼肌原纤维小片化指数影响Fig.4 Effect of hydroxyl radical oxidation system on myofibrillar flake index of Dosidicus gigas

2.5 蛋白氧化对秘鲁鱿鱼保水性的影响

蒸煮损失率和离心损失率是衡量蛋白质保水性的重要指标。图5为羟自由基氧化体系对秘鲁鱿鱼肌肉保水性的影响。由图5可知,氧化后秘鲁鱿鱼肌肉蒸煮损失率随着氧化浓度的增加逐渐升高,且组间差异不显著(P>0.05)。这可能是由于蒸煮仅仅使蛋白质发生变性,对蒸煮损失率影响不大有关。离心损失率与蒸煮损失率具有相同的变化趋势,但不同氧化浓度间离心损失率差异明显。这可能是因为蛋白质氧化导致肌肉组织结构的完整性遭到破坏,肌原纤维间隙变大,使得存在于肌肉组织间隙的自由水难以被束缚,在受到离心作用时,自由水被排出,最终导致肌肉保水性下降,从而降低鱼肉的品质。

图5 羟自由基氧化体系对秘鲁鱿鱼肌肉保水性的影响Fig.5 Effect of hydroxyl radical system on water hold capacity of Dosidicus gigas

2.6 蛋白氧化对秘鲁鱿鱼T2横向弛豫时间的影响

经过氧化处理后的秘鲁鱿鱼水分T2弛豫时间图谱如图6所示,由图可知,弛豫图谱上显示4个峰,分别代表秘鲁鱿鱼肌肉中存在的3种状态的水,即结合水、不易流动水和自由水。其中0～40 ms(T21,T22)间有两个小峰代表结合水,第一个峰表示强结合水,第二个峰表示弱结合水;40～200 ms(T23)的峰为主峰,代表不易流动水;200～1000 ms(T24)间的峰代表自由水。

图6 秘鲁鱿鱼水分T2弛豫时间图谱Fig.6 Transverse relaxation time T2 of water in Dosidicus gigas

表1表示的是各峰与横坐标面积百分比即为各组分水所占百分含量。由表1可知,对于结合水的含量P21和不易流动水的含量P22而言,各处理组差异不显著(P>0.05);而自由水含量P23各处理组存在明显差异,且随着H2O2浓度的增加,自由水含量逐渐增加。这说明氧化使得蛋白质的结构发生改变,从而影响蛋白质与水的结合能力,使得一部分结合水转化为自由水。

表1 秘鲁鱿鱼水分分布及组成Table 1 Water distribution and compositon of Dosidicus gigas

2.7 蛋白氧化对秘鲁鱿鱼物化特性指标间的相关性分析

羰基含量、蒸煮损失率、离心损失率、结合水相对百分含量(P21)、不易流动水相对百分含量(P22)、自由水相对百分含量(P23)、肌原纤维小片化指数(MFI)之间的相关性分析如表2所示。由该表可以看出,羰基与离心损失率、P23、MFI呈极显著正相关(P<0.01);蒸煮损失率与P21呈显著正相关(P<0.05),离心损失率与P22呈显著负相关(P<0.05),与P23呈显著正相关(P<0.05),与MFI呈极显著正相关(P<0.01);P21与P23呈显著正相关(P<0.05);P22与MFI呈显著负相关(P<0.05);P23与MFI呈极显著正相关(P<0.01)。

表2 指标间相关性分析Table 2 Correlation analysis between indexes

3 结论

在羟基自由基氧化体系中,随着氧化浓度的增加,秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白的羰基含量极显著增加(P<0.01),一些生色氨基酸减少,导致蛋白的紫外吸收光谱吸收峰值下降。肌肉微观结构的破坏程度增加,肌纤维间隙增大、结构疏松,并逐步出现肌纤维小片化,肌原纤维小片化指数增加。肌肉保水性指标结果显示,蛋白氧化对肌肉蒸煮损失率影响不大,但显著影响离心损失率(P<0.05),氧化使得蛋白质的结构发生改变,从而影响蛋白质与水的结合能力,使得一部分结合水转化为自由水。由此可见,蛋白质氧化会破坏秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白结构,降低肌肉保水性,进而影响肌肉品质,说明蛋白结构改变与肉及肉制品的食用品质密切相关。因此秘鲁鱿鱼在后续的生产加工过程中应该抑制蛋白氧化,进而保证产品品质。