一种百岁老人源罗伊氏乳杆菌益生特性及其发酵水牛乳制备工艺优化

孙 荟,兰海静,梁晓琳,黄联莉,韦子龙,李全阳,*

(1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004; 2.广西普生三凤乳业有限公司,广西南宁 530226)

益生菌在全球范围内已被人们广泛接受,许多研究结果显示,益生菌制品具有多种生理活性功能,如改善和维持正常的免疫系统[1]、产生抗菌物质、增强粘膜屏障功能[2]及通过排斥肠道病原菌对肠上皮细胞的黏附从而减轻致病菌引发的感染等[3]。

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)是人类肠胃道中的固有菌,我国于2003年[4]将罗伊氏乳杆菌批准为可用于保健食品的益生菌菌种。Chau等[5]的研究表明,罗伊氏乳杆菌DMS 17938对婴儿肠绞痛有明显的改善作用;Savino等[6]在婴儿的饮食中加入罗伊氏乳杆菌DMS 17938后,能够通过减少病原体定植改善肠道健康。舒中玉等[7]通过灌胃小鼠菌液和上清液发现,罗伊氏乳杆菌L0能够显著提高小鼠血液中IL-2和IFN-γ的含量,增强免疫力。但对于罗伊氏乳杆菌遗传过程中的益生特性并未见报道。

广西巴马是中国著名的长寿之乡,郭飞翔[8]和王芳等[9]对巴马长寿老人肠道菌群进行研究,结果显示巴马长寿老人肠道益生菌的丰度显著高于其他地区老人,甚至亲缘性与青年人群接近;喻婷等[10-11]从巴马长寿老人的粪便中筛选出益生特性良好的菌种,但未对其遗传益生特性进行研究。本研究将从百岁老人体内筛选出的罗伊氏乳杆菌与广西特色“奶中之王[12]”的水牛奶结合,探索该菌株在培养至300代过程中益生特性的稳定性,进一步利用其制备益生菌发酵水牛奶,以期为拓展该菌株在新型食品中的应用提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗伊氏乳杆菌LT018 由实验室自行筛选,-80 ℃保存;水牛奶 南宁市雄牛牧业有限公司;脱脂高蛋白奶粉 伊利食品有限责任公司;优质白砂糖 广西东亚糖业有限公司;保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌混合冷冻干菌粉 丹麦DANISCO公司;蛋白糖 南昌市义和食品有限公司;MRS培养基、TPY培养基 青岛海博生物技术有限公司;胃蛋白酶(pepsin 1∶3000) Amresco公司;胰蛋白酶(Trypsin 1∶250) Amresco公司;牛胆汁(oxgall) Sigma公司。

HSS型电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司;DNP-9082BS电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;SW-CJ超净工作台 苏净安泰;DSX-280B高温高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;JRJ300-D-I剪切乳化搅拌机 上海标本模型厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化 罗伊氏乳杆菌LT018经TPY固体培养基连续活化传代两次,挑单菌落至液体培养基中,37 ℃厌氧培养箱培养24 h。

1.2.2 菌株的连续培养 由前期实验[13]得出的生长曲线可知,罗伊氏乳杆菌LT018在12 h时处于生长对数期,因此选定12 h为一个培养周期。根据繁殖代数计算公式[14]得出,每经过12 h繁殖代数约为5.8代。连续传至300代。每隔50代取对数期菌种进行活菌数测定、菌活力测定、对人工胃肠液耐受能力的测定和凝集性测定。

繁殖代数(代)=3.332(lgx2-lgx1)

式中:x1表示0 h时菌株的活菌数,x2表示12 h时菌株的活菌数。

1.2.3 益生特性相关指标的测定

1.2.3.1 活菌数测定 吸取1 mL对数期的活菌液,沿壁加入到含有9 mL的无菌生理盐水中,充分振荡摇匀。连续稀释至合适的浓度,取100 μL稀释菌液进行涂布,37 ℃下恒温培养48 h,计数。

1.2.3.2 菌活力测定 连续培养,每传代至50、100、150、200、250代和300代对数期时,收集各时期的菌液30 mL,4000 r/min 10 min离心收集菌体,加入10 mL的灭菌脱脂乳,37 ℃恒温培养24 h,量取10 mL样品置于250 mL锥形瓶中,加入20 mL蒸馏水,滴入两滴酚酞指示剂,以0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定,记录消耗的NaOH的量,参考国家标准乳和乳制品酸度检测,根据公式[15]计算。

式中:C表示NaOH溶液浓度(mol/mL);V表示滴定NaOH标准溶液所消耗的量(mL);m表示试样的质量(g)。

1.2.3.3 对人工胃、肠液耐受能力的检测 参照朱振军[11]模拟胃液和模拟肠液的配方,每传至50、100、150、200、250、300代对数期,移液枪吸取1 mL菌液加入到模拟胃液中,37 ℃恒温培养3 h,适当稀释后进行涂布计数。同时吸取1 mL菌液胃液混合液加入到模拟肠液中进行37 ℃恒温培养24 h,稀释到合适的浓度进行涂布计数,同时根据公式计算活菌存活率,以活菌存活率作为胃肠液耐受能力的评判标准。

式中:N0-0 h活菌数;N1-经模拟胃液消化3 h后的活菌数;N2-经模拟肠液消化24 h后的活菌数。

1.2.3.4 菌株的凝集性检测 连续培养,每传至50、100、150、200、250代和300代对数期时,取10 mL菌液置于无菌离心管中4000 r/min离心20 min以收集菌体,使用无菌PBS缓冲溶液洗涤后重新悬浮,再用无菌PBS缓冲溶液调节使其OD600值达到0.8,取5 mL重悬液,37 ℃恒温静置培养2 h,取上悬浮液(不摇晃)测定其在600 nm处吸光度,并根据公式计算自凝集率A(%)。

式中:Ai-原始悬浮液OD值;Af-2 h后上悬浮液OD值。

1.2.4 罗伊氏乳杆菌发酵水牛乳工艺流程

发酵剂的制备:将培养至对数期的罗伊氏乳杆菌LT018液体培养基4000 r/min离心10 min收集菌体,以1%的接种量加入到灭菌的水牛奶中,41 ℃培养直至凝固,备用。按照说明书的比例:1.5 g菌粉发酵100 kg水牛奶,取适量菌粉加入水牛奶中,37 ℃培养至凝固,配制保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌发酵剂。

预热、均质:在新鲜水牛乳中加入蛋白糖(添加量为每1 kg牛奶中加入0.8 g蛋白糖),按照实验设计添加白砂糖,在45 ℃下预热后,进行均质。

杀菌、接种:采用巴氏杀菌法对牛乳进行杀菌处理,条件为:95 ℃杀菌5 min。冷却至40～42 ℃后,按照实验设计发酵剂比例进行接种。

发酵、后熟:在不同的温度下进行发酵,发酵至80 °T后停止,在4 ℃下后熟24 h。

1.2.5 单因素实验 控制温度在39 ℃,白砂糖添加量为3%,改变菌种比例(罗伊氏乳杆菌发酵剂:普通发酵剂为1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)对发酵乳的影响;控制菌种比例为2∶1,温度在39 ℃,改变白砂糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%)对发酵乳的影响;控制白砂糖添加量为3%,菌种比例为2∶1,改变温度(37、38、39、40、41 ℃)。通过单因素实验考察各因素对发酵乳乳酸菌活菌数和感官品质的影响,初步筛选出各因素中相对适合添加范围。

1.2.6 响应面优化实验 由单因素实验确定白砂糖添加量、温度、发酵剂菌种比例对感官评定有显著的影响,因此选定这三种因素为影响因素,以发酵乳感官评定作为响应值,使用Design软件设计了中心组合实验(CCD实验),如表1所示。利用Box-Behnken响应面分析法确定产品的最佳工艺参数。

表1 CCD试验因素水平表Table 1 Factors and levels of CCD experiment

1.2.7 发酵乳品质指标的测定

1.2.7.1 乳酸菌活菌数测定 参考国家标准中食品乳酸菌检测办法[16],利用平板计数法对发酵乳中罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行分别计数,测定时间为发酵乳后熟24 h后[17]。

1.2.7.2 感官评定 选择10名食品专业且经过感官培训的人员,对发酵乳的色泽、滋味、气味和组织状态进行描述,并对其进行打分。感官评分如表2,具体标准参考国标[18]。以感官评分结果作为最终响应面实验的评定结果。

表2 感官评分标准Table 2 Sensory scoring standard

1.3 数据处理

本实验数据均为三次重复试验的平均值±标准差。数据采用SPSS 19.0 软件进行统计分析,其中P<0.05表示两组间数值差异显著,P<0.01表示两组间数值差异极显著。使用Graph Pad Prism 7.00对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 连续传代过程中活菌数的变化

如图1所示,罗伊氏乳杆菌LT018在传至300代的过程中,活菌数的变化呈先上升后下降，然后趋于稳定的趋势。它在0代的活菌数较低,主要原因可能是长期处于低温保存状态下,菌株并未马上完全适应培养基环境。在传至100代时,活菌数达到最高值,说明LT018在100代附近最为活跃。从100～300代的过程中,活菌数的趋势是先下降后平缓,LT018是一株适应能力强的菌株,在多次传代过程中可能需要在基础培养基上额外添加营养成分,以此来满足其生长所需原料。但在整个传代过程中,罗伊氏乳杆菌LT018的活菌数一直处于8.89～9.40lg CFU/mL之间的范围,有较高的活菌总数,说明该菌株在遗传过程中活性稳定。

图1 罗伊氏乳杆菌LT018传代过程中活菌数变化Fig.1 Changes in viable counts during the passage of Lactobacillus reuteri LT018

2.2 连续传代过程中菌活力的变化

乳酸菌的产酸能力是判断其是否适用于食品发酵乳的重要指标之一[19]。从实验结果来看,第100代的产酸能力最强,可能是由于其在对数期间活菌数最多;从总体趋势来看,从0～300代,罗伊氏乳杆菌LT018的产酸能力比较稳定,酸度保持在38.44～40.01 °T的范围内,说明这株罗伊氏乳杆菌在传代过程中,产酸能力始终保持在一个稳定的范围内,适合作为食品发酵乳的发酵剂使用[20]。

2.3 连续传代过程中菌株对人工胃、肠液的耐受能力

摄入益生菌后,在肠道内存活能力的高低是评价益生菌是否能发挥其作用的标准之一[21],因此,耐受模拟胃、肠液是评价一株益生菌功能性的重要指标[22]。由实验结果可知在连续培养300代的过程中,除第0代和其余代有明显的差异外,罗伊氏乳杆菌LT018经过模拟胃液的条件后,存活率均保持在在99%以上。李文静等[23]在研究三株罗伊氏乳杆菌时,发现这三株菌在模拟胃液中的存活率为82.22%～91.65%,相比而言,本实验使用的罗伊氏乳杆菌LT018在模拟胃液中的存活率远高于这三株菌,说明罗伊氏乳杆菌LT018对于胃液的耐受能力更强。有研究表明,益生菌要发挥其益生作用,需要在肠道内的存活量达到106CFU/d[24],而罗伊氏乳杆菌LT018在0～300代过程中依然能够保持高于106CFU/mL的活菌数,表明罗伊氏乳杆菌能够在肠道内发挥其益生作用。

表3 罗伊氏乳杆菌LT018连续传代过程中在模拟胃液和肠液中的活细胞计数(lg CFU/mL)和存活率(%)Table 3 Viable cell count(lg CFU/mL)and survival rate(%)in simulated gastric and intestinal fluids during continuous passage of L. reuteri LT018

表4 罗伊氏乳杆菌LT018连续传代过程中的凝集率Table 4 The agglutination rate during continuous passage of L.reuteri LT018

2.4 连续传代过程中菌株的凝集性变化

在肠道内,菌株的自凝集能力是决定其是否能黏附到肠上皮细胞的重要因素[25],它们通过竞争宿主-细胞基质结合位点阻止病原体的黏附和扩散[26]。罗伊氏乳杆菌LT018在0代时凝集率达到最高,为66.8%。在整个传代过程中,50、100代之间的凝集率无显著性差异(P>0.05),200～300代之间虽有显著性差异(P<0.05),但整体凝集率始终保持在55.4%～66.8%的范围内。Klopper等[27]从成人粪便中筛选出几种益生菌并对它测定了自凝集性,其中罗伊氏乳杆菌HFI-LD5的自凝集率在30.73%±6.17%。而罗伊氏乳杆菌LT018连续培养至300代的过程中,凝集率虽有上下波动的趋势,但始终有着较高的凝集性,均高于罗伊氏乳杆菌HFI-LD5的凝集率,以此说明罗伊氏乳杆菌LT018在传代过程中保持较强的黏附肠上皮细胞的能力。

2.5 发酵乳单因素实验结果

2.5.1 温度对发酵乳的影响 温度对发酵乳感官评分和益生菌数的影响如图3所示。随着温度的升高,发酵乳的感官评分和益生菌活菌数逐渐的升高,在40 ℃时,达到最高值,其中感官评定分数为86.1,益生菌活菌数为1.021×108CFU/mL。在41 ℃时感官评分和益生菌数有所下降，主要原因是温度升高有利于酶活的提高[28],使细胞内生命活动不断加速,生长速率加快[29]。发酵温度越高,乳酸菌发酵的效果越好,产酸也越多[19],到达80 °T的时间就越短。但同时,温度过高会超过乳酸菌的最佳发酵温度,会导致发酵乳品质下降[30]。图3表明,温度在39、40、41 ℃范围内发酵乳的感官评定值较高,同时益生菌数量也保持在较高的水平。

2.5.2 白砂糖添加量对发酵乳的影响 糖添加量对发酵乳感官评分和益生菌数的影响如图4所示。在糖添加量为1%～3%时,感官评分和益生菌活菌数都为上升的趋势,添加量超过3%后,感官评分和活菌数呈相反的趋势。白砂糖的添加量较低时,发酵乳滋味偏酸;添加量为3%时,感官评分最高;超过3%时,由于白砂糖添加过量,影响感官评分。而对益生菌活菌数而言,白砂糖可以作为乳酸菌的生长因子,促进乳酸菌的生长,所以呈现出持续上升的趋势[31]。综合分析选用添加量为2%、3%、4%进行下一步响应面试验。

图4 糖添加量对样品感官评分和益生菌数的影响Fig.4 Effects of sugar addition on the samples sensory score and probiotic count

2.5.3 菌种比例对发酵乳的影响 菌种比例对发酵乳感官评分和益生菌数的影响如图5所示。当菌种为1∶1～2∶1时,感官评分持续上升;菌种比例超过2∶1后,感官评分有所下降。菌种比例直接影响到发酵乳的发酵程度[32]。普通发酵剂含量过高,则发酵乳发酵时间过快,发酵乳的持水力不好;益生菌发酵剂过高时,会导致产酸能力不足,发酵乳的状态不佳。由图5可知,比例为1.5∶1、2∶1、2.5∶1时,益生菌活菌数保持在较高的水平,同时感官效果较好。所以根据本实验结果,选取菌种比例为:1.5∶1、2∶1、2.5∶1继续下一步实验。

图5 菌种比例对样品感官评分和益生菌数的影响Fig.5 Effect of strain ratio on the samples sensory score and probiotic count

2.6 响应面优化试验结果

由单因素实验结果得出三个因素的最佳范围,设计了CCD中心组合试验。利用Box-Behnken响应面分析法确定产品的最佳工艺参数,如表5所示。

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken test

对Design expert软件对Box-Behnken试验数据进行二次项拟合,得到的回归方程为:

Y=85.70+1.27A+2.83B+0.75C-1.22AB-0.0058AC-0.88BC-6.07A2-11.90B2-5.66C2。

其中,Y为感官评定的预测响应值,A为温度,B为白砂糖添加量,C为菌种比例。表6为响应面回归方程的方差分析结果(感官评定)。

由表6可知,所建立的模型极显著(P=0.0001<0.001),模型的失拟项不显著(P=0.3041>0.05),说明建立模型在整个回归区域内拟合度较好,模型可信。模型的相关系数R2=0.9983,校正系数R2adj=0.9960,说明预测值和试验值的相关性高,CV值(变异系数)较低为0.69%,说明模型具有较高的精确度,结果可信。由系数显著性可知,因子的一次项A(温度)、B(白砂糖添加量)、C(发酵剂混合比例)及二次项 A2、B2、C2对发酵乳口感均有极显著影响。具体响应曲面图如图6所示。

表6 RSM回归方程方差分析(感官评分)Table 6 RSM regression equation analysis of variance(sensory score)

图6 温度、菌种比例、糖添加量对感官评分影响的响应面图Fig.6 Response surface diagram of temperature, strain ratio,and sugar addition on sensory score

由响应面图和等高线可以看出因素与因素的交互作用对响应值的影响程度。如图6所示,交互项AB和BC之间的等高线均呈椭圆形,说明对于发酵乳感官评分来说,温度与糖添加量和糖添加量与菌种比例之间的交互作用显著。由响应面分析可知,回归模型存在最大值。由回归方程计算得到Y的最大估计值为85.70,此时温度为40.00 ℃,糖添加量为3.00%,菌种比例为2∶1。

2.7 最佳工艺验证实验

根据响应面优化后的实验条件为:温度40.00 ℃,糖添加量3.00%,菌种比例2∶1,进行三次平行实验进行验证。最终感官评分为86.63±1.47,此时益生菌活菌数达到1.033×108CFU/mL,与响应预测值拟合率为 98.92%,说明该响应面优化参数准确,有一定的实际利用价值。

3 结论

罗伊氏乳杆菌LT018在传至300代的过程中,其益生特性稳定,在模拟的肠胃液环境中具有较高的存活性,菌株本身具有优良的自聚合能力。罗伊氏乳杆菌LT018与保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌联合发酵水牛乳的最佳工艺是:发酵温度40.00 ℃,糖添加量3.00%,菌种比例2∶1时,制品的感官评分为86.63,益生菌活菌数达到1.033×108CFU/mL。本研究对罗伊氏乳杆菌LT018的应用提供了理论与技术依据。