草酸诱导哈密瓜采后耐冷性的转录组构建与分析

王 静,刘彩红,吕 卓,张 辉,胡慧慧

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830000)

哈密瓜(CucumismeloL.)属于葫芦科黄瓜属甜瓜亚属的一个变种。因其味道鲜美、酥脆、营养丰富成为世界上最受欢迎的果实之一[1]。由于哈密瓜果实采后衰老迅速,低温贮藏通常被用来延长果实的保质期。但哈密瓜属于冷敏性果实,在低温环境中易发生冷害(CI)。果实的表皮出现大量的褐色凹陷斑块,这是哈密瓜冷害的典型症状[2-4]。对哈密瓜耐冷性方面的研究主要集中于抗氧化活性[3]、耐冷基因的克隆[5]和与低温胁迫相关转录因子CBFs的表达[6]等,而对于其他方面的研究报道较少[7]。目前转录组测序仍然是发现新基因的有效工具[10-11]。因甜瓜基因组相对较小,形态、生理生化特征多样性等特点引发广泛关注,已成为研究葫芦科植物家族基因组学的一个模式植物[8]。2012年甜瓜全基因组测序的完成为研究哈密瓜果实的分子机理提供了良好的基础[9]。所以为控制哈密瓜果实采后冷害的发展,研究和分析其抗寒性的分子转录是有必要的。

有研究报道,热处理[3]、气调包装[12]、NO处理[13]和降低ACC氧化酶表达抑制乙烯合成[14]等手段对哈密瓜采后冷害的发生加以调控。而草酸应用于缓解哈密瓜采后冷害的研究尚未见相关报道。

草酸是一种结构简单的有机酸,在不同生命体中发挥着不同的作用[15],可提高芒果[16-17]、桃[18]和石榴[19]采后的抗寒性,缓解低温贮藏的荔枝[20]和杏[21]冷害,延长果实的保鲜期。然而草酸在果实采后抗冷性过程中的作用仍未充分阐明。因此,本文采用15 mmol/L草酸溶液处理“西州密25号”哈密瓜果实,测定果皮的细胞膜渗透率和MDA的含量并对果皮进行转录组测序,研究外源草酸诱导哈密瓜果实采后耐冷性的分子机理,为挖掘相关耐冷基因提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“西州密25号”哈密瓜(厚皮甜瓜亚种CucumismeloL. var. reticulatus Naud)采自吐鲁番鄯善县商品瓜基地,要求瓜中心平均糖度为15%～16%进行采摘,采收时留3～5 cm果柄,挑选瓜皮呈青色,布满灰色网纹,无伤痕的果实。采后立即用泡沫网状发套将果实单独包装,每个纸箱(40 cm×35 cm×28 cm)中放置4个瓜,于采后4 h内运至新疆农业大学农产品贮运实验室,选择成熟度基本一致、大小适中、无任何机械损伤的果实作为实验材料;三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)和草酸(OA) 均为分析纯,国药集团上海化学试剂公司;次氯酸钠 国药集团上海化学试剂公司;石英砂 国药集团上海化学试剂公司。

上海雷磁DDS-307型电导率仪(雷磁DJS-1C型电导电极) 上海音孚实业有限公司;SIGMA 3-18K型低温高速离心机 上海知信试验仪器有限公司;SP-752型紫外可见分光光度计 上海光谱有限公司;JF2004型电子分析天平 上海麦聚瑞电子仪器有限公司;HH-4型恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 哈密瓜选择及预处理 选择成熟度基本一致、大小适中、无任何机械损伤的果实作为试验材料。将挑选好的哈密瓜果实擦拭干净,浸泡于0.5%的次氯酸钠水溶液中消毒5 min,取出后用自来水充分清洗3遍,在室温环境中自然晾干。然后将哈密瓜完全浸泡于15 mmol/L的草酸溶液(0.5 mL/L吐温-20)中10 min,以蒸馏水(0.5 mL/L吐温-20)浸泡10 min作为对照组。充分晾干后装箱,贮藏于3 ℃机械冷库内。

生理指标的测定分别于处理后第0、7、14、21、28、35、42 d进行取样,每个处理取3个果实,3个重复,共计9个果实,每个指标重复3次。并选取采摘当天的哈密瓜(贮藏第0 d为原始点为YSD)、低温贮藏冷害症状明显的第42 d果实为对照组(C)和草酸处理的样品组(T)为转录组测序的试验材料。每个样品均由9个独立的哈密瓜果皮组织混合构成。高通量测序实验使用3个生物学重复。生理指标和转录组测序的样品均在果实的赤道区域周围取约2 mm厚的果皮组织,混匀后用液氮冷冻并在-80 ℃冰箱中放置。

1.2.2 细胞膜渗透率和丙二醛(MDA)含量的测定

1.2.2.1 细胞膜渗透率 采用电导率仪测定,参照Wang等[30]的方法。分别在哈密瓜的前中后3个部位取果皮后用打孔器取出直径1 cm,切成厚度为5 mm的圆片,每个部位取4片,每个处理3个果实,3个重复,结果以%表示。

1.2.2.2 MDA的含量测定 参照Chen等[31]的方法,取1.0 g哈密瓜果皮组织,加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液,研磨匀浆后于12000×g离心20 min,取上清液2.0 mL 与0.67%硫代巴比妥酸(TBA)混合煮沸20 min,分别测定450、532和600 nm波长的吸光度值。MDA含量表示为nmol·g-1FW。

1.2.3 转录组测序

1.2.3.1 总RNA提取及质量检测 总RNA提取按照Tiangen RNAprep试剂盒说明书的描述进行提取。RNA纯度采用NanoPhotometer® spectrophotometer(IMPLEN,CA,USA)检测。RNA完整性用RNA Nano 6000 Assay Kit在Agilent Bioanalyzer 2100 system生物芯片分析系统(Agilent Technologies,CA,USA)中检测。具体参照文献[22]进行。

1.2.3.2 cDNA文库构建及其质量检测 使用Qubit® 2.0 Fluorometer(Life Technologies Corporation,美国)进行初步定量,稀释文库至1.5 ng·μL-1;然后使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的插入片段大小(Insert size)进行检测;符合预期后,使用qRT-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度> 2 nmol/L),以保证文库质量。qRT-PCR采用QuantStudio 12K仪器进行操作,由三个步骤组成:(1)反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNA;(2)扩增:用PCR的方法扩增cDNA;(3)检测:实时检测和定量扩增的产物.

总RNA样品检测合格后,用带有Olog(dT)的磁珠富集mRNA;其测序文库构建使用NEB建库试剂盒(产自美国),使用Agencourt® AMPure XP磁珠纯化PCR产物并得到最终产物。具体参照文献[22]进行。

1.2.3.3 测序工作 转录组测序工作委托诺禾致源公司完成。

1.2.3.4 生物信息分析 (1)高通量测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序数据(Raw Reads),结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储。

(2)测序数据质量评估:a. 错误率分布检查;Illumina Hiseq® 2500的碱基质量值用Qphred=-10log10(e),其中e为错误率。b. 数据过滤;原始测序序列Raw reads,其含有带接头和低质量的Reads。为确保信息分析质量,需对Raw reads过滤,得到过滤后的测序数据(Clean reads),其后续分析均基于Clean reads。

Raw reads过滤条件:①去除带接头(Adapter)的Reads;②去除N(N为无法确定碱基信息)的比例大于10 %的Reads;③去除低质量Reads(质量值Qphred≤ 5的碱基数占整个read的50%以上的Reads)。

(3)转录本拼接采用Trinity软件(v2012-10-05;其中min_kmer_cov为2,其它参数为默认模式),原理参照Grabherr等对clean reads进行拼接。

(4)基因功能注释在本实验中,基因功能注释所用到的数据库为:Nr(NCBI non-redundant protein sequences)是NCBI官方的蛋白序列数据库;Nt(NCBI nucleotide sequences)是NCBI官方的核酸序列数据库;Pfam(Protein family)蛋白数据库;Swiss-Prot蛋白序列数据库;KOG/COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)基因功能注释数据库;KO(KEGG Ortholog database)基因功能注释数据库和GO(Gene Ontology)基因功能注释数据库。参照文献[22]进行。

1.3 数据分析

采用Excel进行处理试验数据,用SPSS 20.0软件进行方差和显著性分析。LSD测试确定均值的差异,P<0.05为显著性。用Origin 8.0 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 草酸对哈密瓜细胞膜渗透率和MDA含量的影响

冷藏0～7 d,草酸处理组和对照组的哈密瓜膜渗透率下降,但冷藏7 d后,两组的膜渗透率逐渐上升,说明低温冷藏加剧膜脂氧化。除第21 d外,草酸处理组哈密瓜的膜渗透率显著低于对照组(P<0.05)(图1A),表明草酸处理一定程度可降低膜渗透率的上升,但不能完全抑制。

图1B显示贮藏期间(0～28 d),对照组和草酸处理组哈密瓜MDA含量不升反而逐渐下降,分别在第28和35 d开始急剧上升,说明草酸处理可推迟MDA含量急剧上升的时间,冷藏至42 d时,对照组哈密瓜的MDA含量较草酸处理组高3倍,表明草酸处理极显著抑制MDA含量的上升(P<0.01)。

图1 草酸处理对哈密瓜细胞膜渗透率和MDA含量的影响Fig.1 Effect of OA treatment on relative electrolyte leakage and MDA content in Hami melon注:A为草酸处理对哈密瓜细胞膜渗透率的影响; B为草酸处理对哈密瓜MDA含量的影响。

2.2 哈密瓜冷害症状分析

由图2可以看出,在3 ℃条件下,贮藏至第42 d,对照组C和草酸处理组T均出现比较严重的冷害症状,且C较T严重,褐色凹陷斑块明显增多。说明草酸处理组在一定程度上可以减轻冷害症状,但不能完全抑制。同样YSD与C相比,也可以发现42 d的低温冷藏导致果实出现低温迫害,冷害症状出现。

图2 采收当天(YSD)、冷藏42d的对照组(C)和草酸处理组(T)哈密瓜冷害症状图Fig.2 Chilling injury in Hami melon fruit at harvest YSD and 42 days at cold storage control and OA treatment 注:A:采收当天(YSD);B:冷藏42 d的对照组; C:冷藏42 d的草酸处理组。

2.3 哈密瓜转录水平调控分析

2.3.1 哈密瓜RNA提取结果分析 从图3可看出,所有样本的RNA条带清晰,说明本实验提取的RNA符合转录组试验的要求。

图3 不同哈密瓜RNA电泳图谱Fig.3 Total RNA of the flesh of Hami melon in agaroseael electrophoresis

2.3.2 转录组数据可靠性分析

2.3.2.1 转录组碱基序列分析 表1结果显示,哈密瓜果皮测序后,共获得435224080条原始序列片段,过滤后序列数为418943882条,过滤后Q20碱基比率为97.52%,碱基错误率为0.11%,GC值为42.78%。可见,测序可满足后续数据组装及处理的要求。

表1 哈密瓜果实测序产量统计Table 1 Output statistics of sequencing of Hami melon fruit

2.3.2.2 组装重叠片段(Contig)和基因片段(Unigene)长度分布 使用Trinity软件对过滤后的序列进行组装,获得了252169条contig片段,总长274752807 nt;获得了153128条Unigene,总长245819499 nt,其中聚类的Unigene数目为75266条,单独的Unigene数目为77862条(表2)。N50是衡量转录本拼接大小的重要指标之一,较平均长度和中值长度更为合理;N50>1500 bp即可认为所拼接转录本可代表该转录组的全长转录本[25]。本文中拼接出转录本的N50为2290 bp,且基因的N50为2592 bp(表2),因此所得转录本可作为哈密瓜果实的全长转录本。

表2 哈密瓜转录组组装质量统计Table 2 Assembly quality statistics of Hami melon transcriptome

2.3.2.3 哈密瓜转录组的Unigene长度分布 由表3可知,本研究拼接出252169个转录本,含有153128个基因。组装出的153128条基因中,200～500 bp的有34086条占总基因的22.26%;500～1 kbp的有41180条,占26.89%;1～2 kbp有36391条,占23.77%;大于2 kbp的为41471条,占27.08%。

表3 转录本拼接长度频数分布Table 3 The frequency distribution of transcript length

2.4 转录组数据分析

2.4.1 哈密瓜转录组的Unigenes功能注释及COG分类 由表4可以得出,在153128条基因中,94792条基因(61.90%)、122307条基因(79.87%)和81294条基因(53.08%)可以比对到Nr、Nt和Swiss-Prot数据库。在KOG数据库中有39873条(26.03%)基因可以用来预测功能。在Go数据库中有81337条基因可以映照到不同的功能节点上。

表4 基因功能注释成功率统计表Table 4 Function annotation of unigenes

2.4.2 Unigene在NR数据库中的注释分类结果 本文采用无参的方法进行转录组试验。表5结果显示,样品注释到NR数据库的基因数目(94792条)与甜瓜已发表基因组序列匹配度最高,达56%;其次是黄瓜8.7%;大麦1.8%和葡萄1.4%,基因数目分别为53083条、8284条、1670条和1363条。

表5 注释到NR数据库的分类结果Table 5 Species classification in NR database

2.4.3 Unigene在KOG中的功能分类 表6显示,转录组中有153128条(表2所示)基因与KOG数据库中的基因有对应关系。根据功能可将基因分为26类,其中,基因数目较多的前三类分别是:翻译后修饰,蛋白质周转,分子伴侣为5275条,占11.97%;其次是一般功能预测基因数量为5167条,占11.73%;第三为翻译、核糖体结构和生物发生的基因数量为3481条,占7.9%。未知的蛋白基因数量最少,仅为2条。

表6 Unigene在KOG中的功能分类及分布Table 6 Functional classification and distribution of unigene in KOG

2.4.4 Unigene在GO功能中的分类 GO(Gene Ontology)富集分析反映出在生物过程(BP)、细胞组分(CC)与分子功能(MF)富集的GO term上分布的差异基因数目情况。代谢过程、细胞和束缚分别是BP、CC和MF上显著富集的GO terms。表明这些GO terms对哈密瓜采后耐冷性提高起着重要的作用,其中代谢过程的基因条目数比较多,在GO中明显得到富集(表7)。

表7 GO功能的分类Table 7 GO classification of unigene

2.4.5 Unigene在代谢通路的分析 转录组测序得到的153128条基因(表2所示),其中有33346条基因比对到KEGG数据库进行代谢通路注释(图4)。注释到细胞过程(2059条),环境信息处理(1248条),遗传信息处理(9482条),代谢(19546条),有机系统(1013条)五大代谢通路。其中代谢通路种的基因数目比较多,以碳水化合物代谢为代表。对这些基因功能的挖掘,将为采后哈密瓜对外界逆境的分子应答及草酸调控机制奠定基础。

图4 代谢通路Fig.4 Metabolic pathways

3 讨论与结论

“西州蜜25号”哈密瓜属于典型的呼吸跃变果实,通常采用低温贮藏延长其市场供应。但是该品种哈密瓜对低温比较敏感,长时间低温贮藏通常会引发冷害,尤其是离开低温到达常温下,冷害症状更加明显,继而发生腐烂,严重影响货架期销售。因此本文采用草酸(OA)对哈密瓜采后进行处理,结果表明,草酸处理降低哈密瓜果皮中细胞膜渗透率和MDA含量,缓解采后冷害发生。

结合表面特征和生理学特性,本研究利用Illumina平台对选择的原料果皮进行转录分析。结果获得过滤序列数为418943882条,使用软件Trinity对过滤序列进行组装,获得了153128条unigenes,总长245819499 nt。unigene的N50为2592 bp(表2),所得转录本可作为哈密瓜果实的全长转录本。共有71.28%的unigenes比对到NR数据库中。注释到NR数据库中的unigenes有56%匹配到已发表甜瓜基因组序列(表5)。有部分unigenes尚未比对到NR、NT和Swiss-Pro数据库,可能是哈密瓜低温胁迫或草酸调控过程中新发现的转录本,尚需做进一步验证。

在GO功能分类中代谢过程的基因条目数比较多,得到显著富集(表7)。表明哈密瓜在低温胁迫和被草酸调控的过程中,代谢过程占主导地位。为系统分析基因产物在细胞中的代谢途径,以及这些基因产物的功能,将本次转录组测序得到的153128个unigenes比对到KEGG数据库进行Pathway注释。结果发现,有33346个(21.8%)成功获得注释,主要映射到五种不同的通路上,其中代谢通路中的基因数目较多,且以碳水化合物代谢为主(图4)。更进一步说明在此次转录组测序中代谢过程的重要性。与单春会等对青霉菌侵染前后哈密瓜转录组构建和分析结果有所不同[29]。

研究表明,果蔬采后与低温逆境胁迫相关的代谢通路常见有:活性氧代谢[3]、细胞膜脂氧化代谢[26-27]、渗透调节物质脯氨酸代谢[16]、磷脂代谢[28]和糖类代谢[21]等,且目前草酸处理调控低温敏感性果蔬冷害的研究也主要涉及这几方面[16,20-21]。根据本研究的初步分析,预测低温冷藏的哈密瓜和草酸调控其冷害的代谢过程,与活性氧、细胞膜脂、脯氨酸与精氨酸及糖类代谢有关。因为一些与活性氧代谢相关的酶如POD、APX和GR等基因的表达水平上调[32];并在后续的研究结果中发现:与细胞膜脂代谢有关的LOX和PLD在低温诱导及草酸调控过程中基因表达水平也呈现显著性变化;且脯氨酸与精氨酸代谢在不同处理组之间被GO显著富集情况也不同,冷藏42 d的草酸处理与对照富集系数Q-value为2.73-17,在贮藏0 d与冷藏42 d的对照果实中富集系数(Q-value)为0.058;在KEGG富集中糖类代谢在不同处理组之间表现不同,蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶基因及葡萄糖苷酶基因和在冷藏42 d的草酸处理与对照中呈显著正调控,表明草酸处理诱导糖类代谢发生变化,从而降低冷害(正在撰写)。与图4中的碳水化合物代谢占主导相吻合。接下来将对三组样品在GO和KEGG中富集的角度出发,分析研究哈密瓜采后抗冷及草酸调控的诱导机理。有望为采后哈密瓜相关耐冷性基因的表达调控奠定相关基础,为哈密瓜采后对低温耐受性的非生物保鲜技术提供理论依据。