腌韭菜根中腐败菌的分离鉴定及防腐剂对其抑制作用

胡秀虹,李 培,2,邓先银,王 翔,2,*,张廷辉

(1.凯里学院大健康学院,贵州凯里 556011; 2.黔东南民族药综合利用工程技术研究中心,贵州凯里 556011; 3.黔东南州食品药品检验检测中心,贵州凯里 556011)

韭菜根是百合科葱属多年生草本植物宽叶韭(AlliumhookeriThwaites)(又称大叶韭)的肉质根,其味辛、性温,富含胡萝卜素、蛋白质、氨基酸、维生素等营养成分及硒、锌、锰、钙、铁等多种人体必需的微量元素,有温中开胃、行气活血、补肾助阳等功效[1-3]。腌韭菜根是贵州黔东南的一款地方特色食品,是采集贵州境内原生态韭菜根,经洗净晒干后拌以辅料或腌制、罐装,味道非常鲜美[4-6]。近年来,随着贵州经济的发展,旅游业及我国大健康产业快速兴起,韭菜根原生态食品以其保健功效、独特的风味,逐渐得到推广和人们的认可。

然而,韭菜根原料水分含量高，营养丰富,极易因滋生微生物而腐败,且韭菜根加工所用辅料种类较多、来源复杂,生产企业基础薄弱、环境条件差、技术落后,生产过程中的微生物源头和二次污染均难以控制。相关文献报道[7-9],致使蔬菜腌制品腐败的微生物主要是芽孢杆菌属和酵母菌,其中大多数为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。添加防腐剂是目前市场上最常使用的防腐保鲜方法之一,防腐剂能抑制食品中微生物的生长繁殖,防止食品变质腐败,从而延长食品的保质期和货架期[10-11]。目前,关于韭菜根腌制品中腐败微生物的相关研究还未见报道,故本研究以胀袋变质的真空包装韭菜根为原料,从中分离筛选出优势腐败菌,通过形态学特征、生理生化试验和16S rRNA基因序列分析鉴定引起真空包装韭菜根变质腐败的主要微生物,并考察几种常用防腐剂对其抑制作用,以期为腌韭菜根生产过程的质量控制提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腌韭菜根(原材料经灭菌真空包装后胀袋变质) 贵州麻江裕沃生态农业发展有限公司;营养琼脂培养基(Nutrient Agar,NA)培养基、营养肉汤(Nutrient broth,NB)培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司;防腐剂(EDTA、苯甲酸钠、焦亚硫酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠,均为食品级) 南通奥凯生物技术开发有限公司;琼脂糖 上海玉博生物科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)、1492R(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 上海生工生物工程股份有限公司。

SW-CJ-2D型双人净化工作台 郑州宏朗仪器设备有限公司;GZX-158A型智能光照培养箱、LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海中安医疗器械厂;DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂;Gel DOC XT凝胶成像系统仪 美国BIO-RAD;2720 thermal cyclerPCR仪 Applied Biosystems;倒置光学显微镜 日本Olympus;S-3400N扫描电镜 日本日立公司;LGJ-100四环冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腐败细菌的分离纯化与筛选 在无菌操作下,分别从5包胀袋变质的腌制韭菜根中随机取样25 g,剪碎,放入装有225 mL无菌生理盐水的无菌均质袋中,用无菌均质器拍击均质5 min(拍击速度为8次/s),制成1∶10的样品匀液。将样液按10倍依次进行梯度稀释,分别从10-2、10-3样液中吸取0.1 mL置于NA培养基上涂布,37 ℃培养24 h,从NA平板上挑取典型生长的单菌落并反复划线纯化,获得单菌株。将分离纯化得到的各菌株平板活化培养12 h,挑起菌体用无菌水制成菌悬液,使菌体浓度约为105～106cfu/mL。

将灭菌后的韭菜根浸于各单菌种菌悬液中,10 s后取出晾干,再置于无菌袋中真空包装,以未接腐败菌的韭菜根作对照,37 ℃恒温保存20 d。从是否发生胀袋及韭菜根感官变化方面进行比较,使韭菜根样品较快腐败的接种菌株作为优势腐败菌。

1.2.2 腐败细菌的菌种鉴定

1.2.2.1 形态学及生理生化鉴定 参照《微生物学实验教程》[12]操作,将已纯化的菌株接种至NA培养基,37 ℃培养18～24 h后观察其菌落形态特征并进行革兰氏染色及芽孢染色试验。参照文献[13]制备细菌扫描电镜样品,观察菌体形态。参照《微生物学实验》[14]和《常见细菌系统鉴定手册》[15]进行部分生理生化实验。

1.2.2.2 16S rRNA基因序列测定 按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作提取细菌基因组DNA,采用1%琼脂糖电泳检测DNA提取质量和片段大小。采用通用引物27F和1492R,以细菌基因组DNA为模板,进行16S rRNA序列扩增。扩增反应体系(25 μL):基因组DNA 0.5 μL,10×Buffer(Mg2+)2.5 μL,引物(20 pmol/μL)各0.5 μL,Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL,加ddH2O至25 μL。反应条件为:94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经凝胶电泳分析后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果用GenBank中的Blast进行同源性比较,通过Clustal X软件进行多序列比对,MEGA 5.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.3 防腐剂对腐败细菌的抑制研究 根据国家标准GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》[16]和相关报道结果[10],选择苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、EDTA、山梨酸钾、焦亚硫酸钠作为防腐剂,以无菌生理盐水配制质量浓度为500 μg/mL的防腐剂母液,0.22 μm无菌滤膜过滤除菌,结合实际生产使用情况,防腐剂的名称及具体添加浓度如下:

比浊法[10]:将试验的各菌株活化培养后用营养肉汤培养基稀释,使培养基中的菌株初始菌量为500 CFU/mL,按表1各防腐剂的添加浓度加入一定量的防腐剂母液至培养基中,将其置于37 ℃下摇床培养24 h,以接种菌株但不加防腐剂为对照组,然后于600 nm下测定其OD值,平时试验三次,并计算抑制率。

表1 5种防腐剂的质量浓度Table 1 Mass concentration of five preservatives

1.3 数据处理

根据上述公式分别计算各防腐剂不同浓度对腐败菌株的抑制率,并将其转化为概率值。利用Excel 2010计算出各防腐剂的毒力回归方程、IC50及其RSD值。

2 结果与分析

2.1 腐败细菌的分离筛选

通过稀释涂布及平板划线培养从胀袋变质的腌韭菜根中分离纯化出17株单菌落,经多次传代培养筛选,有11株长势良好,其菌落形态稳定。致腐能力测试发现编号为XB1、XB2、XB9、XB10、XB11的菌株使韭菜根腐败的较快,其中XB1、XB9可使真空包装腌韭菜根在15 d内发生胀包,XB2、XB10、XB11使韭菜根色泽变暗。

2.2 腐败细菌的形态及生理生化鉴定

表2是5株腐败细菌的菌落形态结果。由表2可知,筛选出的5株腐败细菌的菌落从形状、大小、颜色、隆起度、表面质地及边缘等方面均存在一定的差别,如XB1菌落大且呈扩展形,中间乳白边缘浅黄透明,粘稠;XB2菌落的特点是灰白色,边缘缺刻状;XB9菌落,乳白色粘稠,菌落表面培养初期光滑后期发生褶皱;XB10菌落,浅黄色,呈凸透镜状隆起;XB11菌落的特征最明显,菌落大且不规则,扁平,油脂质地,表面褶皱边缘呈波状。图1为各株腐败菌的扫描电镜结果,A、B、C、D、E分别表示菌株XB1、XB2、XB9、XB10、XB11。XB1菌体呈棒杆状,表面光滑、无鞭毛、无纤毛、产芽孢;XB2菌体呈短杆状,表面不光滑、无鞭毛、有纤毛、产芽孢;XB9菌体呈球杆状,表面光滑、无鞭毛、无纤毛、产芽孢;XB10菌体呈球杆状,表面光滑、无鞭毛、无纤毛、产芽孢;XB11菌体呈杆状,表面褶皱有凹陷、无鞭毛、无纤毛、产芽孢。菌株的菌落及菌体形态在一定程度上会受到培养条件、培养时间、传代次数等因素的影响,且有些菌株在生长过程中会出现较明显的球杆变化。各株腐败菌的部分菌体形态学特征和生理生化试验结果分别见表3和表4。由表3可知,所有腐败菌株均为革兰氏阳性产芽孢杆菌。表4结果表明,所有腐败菌株均能水解淀粉;除XB9和XB11外,其他三株菌接触酶反应阳性,表明其能产生过氧化氢酶;除XB10外,其余菌株硝酸盐还原阳性,表明这些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐;XB2、XB10、XB11菌株能液化明胶,表明这些菌株具有较强的水解蛋白质的能力;所有菌株都具有一定的糖发酵产酸或产气的能力。由此推测,具有产气能力的菌株是引起韭菜根产品胀袋的主要腐败菌,产酸和产吲哚菌株是导致韭菜根异味的主要腐败菌,产酶菌株会导致韭菜根软化,具有水解淀粉和蛋白质能力的菌株会影响韭菜根品质,降低其营养价值。根据已有报道[7-8,17]结合上述实验结果综上分析,真空包装腌韭菜根中的5株腐败细菌可初步确定为芽孢杆菌属。

表2 腐败菌的菌落形态特征Table 2 Colony morphology characteristics of spoilage bacteria strains

图1 腐败菌的扫描电镜照片Fig.1 Scanning electron microscopy of spoilage bacteria strains

表3 腐败菌的菌体形态特征Table 3 Morphology characteristics of spoilage bacteria thallus

表4 腐败细菌的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria strains

2.3 分子生物学鉴定与系统发育树构建

经测序,5株腐败细菌的16S rRNA基因序列大小约为1500 bp,均符合细菌16S rRNA序列长度。将各菌株序列在NCBI网站上进行比对,利用MEGA5.0软件分析其与芽孢杆菌属内相关种的同源性,构建系统发育进化树,结果见图2。由图2可知,发育树中XB1、XB9、XB10的16S rRNA序列与Bacillus中的B.megaterium(GenBank登录号为KC477208.1)在同一个分支上,亲缘关系最近;XB2、XB11的16S rRNA序列与B.toyonensis(GenBank登录号为KX458036.1)在同一个分支上,亲缘关系最近;其序列相似性均大于99%。另外,从图2可以看出,菌株XB1、XB9、XB10与B.megaterium聚为一簇的可信度为86%,菌株XB2、XB11与B.toyonensis聚为一簇的可信度为100%。综上,XB1、XB9、XB10可鉴定为B.megaterium;XB2、XB11鉴定为B.toyonensis。不过,同一种属的XB1、XB9、XB10及XB2、XB11在生理生化及形态上均有细微差别,分析原因可能是环境条件导致了菌种的变异,致使其某些性能的改变,其分类学地位的最终确定仍需利用DNA-DNA分子杂交。

图2 腐败菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of spoilage bacteria strains

2.4 防腐剂对腐败细菌的抑制试验结果

由表5～表9可以看出,不同防腐剂对5株腐败菌的抑制效果有明显差异。苯甲酸钠的IC50为5.63～10.11 μg/mL,山梨酸钾的IC50为11.24～31.33 μg/mL,脱氢乙酸钠的IC50为10.07～18.60 μg/mL,EDTA的IC50为20.68～40.70 μg/mL,焦亚硫酸钠的IC50为15.74～36.37 μg/mL。一般IC50值越大,表明越安全,其抑制作用就越差。由此可知,苯甲酸钠、脱氢乙酸钠对5株腐败菌具有普遍较好的抑制效果,其次是山梨酸钾,而焦亚硫酸钠、EDTA对5株腐败菌整体均表现出较弱的抑制作用。则不同防腐剂对同一种腐败菌的抑制效果有明显差异,同一种防腐剂对不同种属腐败菌的抑菌效果不同且对同种细菌的不同菌株的抑菌效果也存在差异,这与相关研究报道一致[17]。

表5 不同防腐剂对XB1菌株的毒力Table 5 Toxicity of different preservatives to XB1 strain

表6 不同防腐剂对XB2菌株的毒力Table 6 Toxicity of different preservatives to XB2 strain

表7 不同防腐剂对XB9菌株的毒力Table 7 Toxicity of different preservatives to XB9 strain

表8 不同防腐剂对XB10菌株的毒力Table 8 Toxicity of different preservatives to XB10 strain

表9 不同防腐剂对XB11菌株的毒力Table 9 Toxicity of different preservatives to XB11 strain

3 结论与讨论

本研究从胀袋变质的腌韭菜根中分离筛选出5株优势腐败细菌,经鉴定全为芽孢杆菌属,初步确定由3株Bacillusmegaterium和2株Bacillustoyonensis组成,其分类学地位的最终确定仍需利用DNA-DNA分子杂交。经革兰氏染色,5株腐败菌均为阳性,其中XB1不产酸产气,XB9产酸产气,XB2、XB10、XB11产酸不产气。防腐剂抑菌试验表明,不同防腐剂对同一种腐败菌的抑制效果有明显差异,同一种防腐剂对不同种属腐败菌的抑菌效果不同且对同种细菌的不同菌株的抑菌效果也存在差异,综合分析抑菌效果从高到低依次为:苯甲酸钠>脱氢乙酸钠>山梨酸钾>焦亚硫酸钠>EDTA。

微生物生长繁殖是导致真空包装腌韭菜根腐败胀包的主要原因。本研究分离获得的腐败菌种类及特征与以往的报道相符,同时也存在区别[7-9]。Bacillusmegaterium为常见食品腐败菌,而Bacillustoyonensis在食品腐败微生物研究的文献中未见报道,但Kantas等[18]报道该菌种是蜡状芽孢杆菌的一种自然发生的非产毒性非致病性菌株,可作为仔猪的饲料添加剂,还能提高绵羊对牛疱疹病毒5型疫苗的免疫应答[19],张立强等[20]曾从热带雨林土壤中分离得到并证明其具有抗根结线虫活性。此外,化学合成防腐剂的安全性一直备受质疑,故后期研究可考虑天然、安全、高效的天然防腐剂[11,21]。本研究分离得到的腐败菌,可作为腌韭菜根的防腐保鲜处理中的目标菌,为下一步进行腐败过程中的感官与品质变化、天然防腐剂的筛选与应用以及灭菌工艺研究提供有价值的指导。