植物乳杆菌发酵蓝莓果汁工艺优化及其抗氧化能力

李虹甫,杨鑫焱,刘昕宇,张 宇,满朝新,姜毓君

(东北农业大学食品学院 乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

蓝莓,杜鹃花科越橘属植物,果实富含多种有机酸、维生素及膳食纤维,还含有丰富的酚类物质,使其具有较强的自由基清除能力,对炎症、心血管疾病、癌症都具有良好的预防作用。蓝莓中的多种功能活性物质对氧化损伤的预防和缓解能力也早已得到证实[1-2]。因此,联合国粮农组织将蓝莓列入“人类五大健康食品”[3-4]。蓝莓较高的营养价值也使其经济价值不断升高,但蓝莓成熟期集中于夏季,且果实皮壁轻薄,在贮藏、运输中极易因挤压、震荡造成破损导致腐败酸化,严重的影响其经济价值[5]。因此,蓝莓深加工技术是有效解决当前问题的最佳手段。

氧化损伤是人体衰老的主要原因,另外其还可引起高血脂、糖尿病及心脑血管疾病等多种疾病[6]。大量研究表明，乳酸菌具有较强的抗氧化能力,能够改善人体肠道内的活性氧分子变化,清除氧化应激产生的多种自由基[7-8],发酵果蔬制品近年来愈发引起人们的关注,为乳糖不耐症人群提供了新的选择[9],还可避免发酵乳制品中的高胆固醇带来的危害[10]。本研究将乳酸菌与蓝莓结合,一方面可解决蓝莓鲜果的贮藏问题;另一方面还可将乳酸菌的益生功能与蓝莓中的天然功能物质进行结合,开发新型功能食品。因此,本研究选择本实验室自西藏传统乳制品中分离的一株已证明具有免疫调节功能的植物乳杆菌LJ26,进行蓝莓果汁发酵工艺的优化,探究在发酵过程中功能活性物质的变化,并通过体外及细胞实验对发酵前后的抗氧化能力进行比较,为蓝莓深加工和生产研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓 产地辽宁大连,采摘时间2018年8月,4 ℃保存;植物乳杆菌LJ26 分离自西藏传统发酵乳制品;人结肠癌Caco-2细胞 中科院上海细胞库;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium Blue chloride,NBT)、超氧化物气化酶(SOD)活性检测试剂盒、还原性谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒等 北京索莱宝有限公司。

SPX-70B生化培养箱 斯必克冷却技术有限公司;苏泊尔 SJ201A-250 型榨汁机 浙江苏泊尔股份有限公司;YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;UV3000型紫外分光光度计 日本岛津公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓果汁样品制备 解冻经清洗处理后的蓝莓果实,果实与灭菌后纯净水比例1∶2 (w/w)充分打浆后,95 ℃灭菌10 min,然后冷却至室温后采用80目滤网过滤后备用[11]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 发酵剂接种量的确定 准备5组果汁样品,补充6%葡萄糖(g/L),3%脱脂乳粉(g/L)后分别按1%、2%、3%、4%和5%对果汁进行接种植物乳杆菌LJ26(1×108cfu/mL,v/v),随后置于37 ℃发酵24 h后于4 ℃静置2 h 以停止发酵,以活菌数为指标对样品进行检测,确认最佳接种量[11]。

1.2.2.2 发酵温度的确定 准备5组果汁样品,添加6%葡萄糖(g/L),3%脱脂乳粉(g/L)后接种3%植物乳杆菌LJ26(1×108cfu/mL,v/v),分别置于31、34、37、40、43 ℃下发酵24 h。然后于4 ℃静置2 h以停止发酵。以活菌数为指标对各组样品进行检测,确认最优发酵温度[12]。

1.2.2.3 发酵时间的确定 准备5组果汁样品,添加6%葡萄糖(g/L),3%脱脂乳粉(g/L)后,接种3%植物乳杆菌LJ26(1×108cfu/mL,v/v),分别置于37 ℃下分别发酵0、12、24、36和48 h。然后于4 ℃静置2 h以停止发酵。在发酵完成后以活菌数为指标对各组样品进行检测,确认最优发酵时间[12]。

1.2.3 响应面优化试验 发酵工艺参数响应面试验:根据单因素试验的结果,利用Box-Benhnken进行试验设计,以感官评价分数为响应值,对发酵温度(A)、发酵时间(B)、发酵剂接种量(C)三个自变量因素进行优化试验,试验因子水平编码见表1。

表1 Box-Benhnken中心试验因素水品编码Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.2.4 功能物质检测

1.2.4.1 酚类物质含量检测 采用福林酚比色法对总酚量进行检测,参考张洋婷等人方法略有改动[13]。移取待测样品1 mL于试管中,加入等体积稀释后的福林酚试剂充分混匀后静置5 min后,加入2 mL 质量分数7.5%的Na2CO3溶液混匀静置5 min,45 ℃避光水浴10 min后,于波长765 nm处检测吸光度。以没食子酸(1～6 μg/mL)为对照品作标准曲线,检测结果以没食子酸当量表示。

1.2.4.2 花青素含量检测 采用pH示差法对总花青素量进行检测,参考Lee等[14]的方法略有改动。样品稀释10倍后分别移取1 mL样品于两个试管中,分别加入9 mL的0.025 mol/L氯化钾溶液(pH=1)和0.4 mol/L乙酸钠溶液(pH=4.5),于520和700 nm处进行吸光度检测。总花青素量按如下公式进行计算。

式中:A=(A520-A700)pH1-(A520-A700)pH4.5;MW=449.2;DF=溶液稀释倍数;ε=26900花青素-α-D-葡萄糖苷的摩尔消光系数;1为路径长度常数。

1.2.5 体外抗氧化能力检测

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 首先将DPPH溶于甲醇溶液,配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液,取此溶液2 mL分别与1 mL果汁及发酵果汁,室温避光孵育30 min,在517 nm处测量吸光值[15]。

其中,As为样品组吸光值;Ac为对照组吸光值(用蒸馏水取代样品)。

1.2.5.2 清除超氧阴离子自由基能力比较 使用100 mmol/L PBS(pH7.4)分别配制300 μmol/L NBT,936 μmol/L NADH及120 μmol/L PMS。取上述试剂各50 μL加入96孔板,再加入50 μL果汁或发酵果汁。混匀后室温静置5 min于560 nm处检测吸光度[16]。

其中,As为样品组吸光值;Ac为对照组吸光值(用蒸馏水取代样品)。

1.2.6 细胞氧化损伤缓解试验

1.2.6.1 氧化损伤模型构建 采用H2O2处理Caco-2细胞构建氧化损伤模型,通过细胞存活率判断模型构建情况,一般选择细胞存活率95%时的H2O2浓度作为氧化损伤模型的构建浓度,以MTT法确定适合H2O2浓度[17],试验操作如下:活化后的Caco-2细胞以1×105浓度接种至96孔板,待细胞达到单层贴壁后,开始试验。配制0、25、50、100、150、250、500、1000、1500 μmol/L的H2O2,每孔加入100 μL培养30 min,移除H2O2后每孔再加入20 μL MTT试剂培养。4 h后每孔加入150 μL二甲基亚砜,振荡混匀后于490 nm处检测吸光度。

1.2.6.2 细胞抗氧化酶活性测定 首先将Caco-2细胞以3×105浓度接种于6孔板中培养至单层贴壁状态,随后将细胞进行分组试验。分组情况及处理方法如下:空白组:不经氧化损伤处理;损伤组:根据1.2.6.1结果,每孔中加入3 mL浓度为500 μmol/L的H2O2,构建氧化损伤模型后移除剩余H2O2,每孔加入3 mL不含双抗及胎牛血清的DMEM处理4 h;阳性对照组:氧化损伤处理后移除H2O2,每孔加入3 mL 0.01%(w/v)VC溶液处理4 h;试验组:氧化损伤处理后移除H2O2,加入3 mL未发酵蓝莓果汁或发酵蓝莓果汁处理4 h。试验结束后,收集细胞,无菌PBS清洗3次后,根据试剂盒方法对细胞SOD活性、GSH含量进行检测。

1.2.7 感官评价 选取7名人员对发酵蓝莓果汁进行感官评价,以滋味(30分)、气味(30分)、色泽(20分)、质地状态(20分)为评价项目,具体评分标准如下表所示[18]。

表2 发酵蓝莓果汁感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented blueberry juice sensory evaluation criteria

1.3 数据处理

以上实验每组设置3个平行,结果值以平均值±标准差的形式表示,利用ANOVA方法分析组间显著性,以p≤0.05为标准进行统计分析。所有数据和图表均相应用SPSS软件(19.0版)和Origin软件(8.0版)进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 初始接种量的确定 如图1所示,在初始接种量较低时,随初始接种量的增多,发酵蓝莓果汁的活菌数越高。当初始接种量达到3%及以上时,发酵蓝莓果汁的活菌数变化趋近平缓,因此选择初始接种量3%～5%进行后续研究。

图1 初始接种量对活菌数的影响Fig.1 Selection of the initial inoculum size注:图中不同字母间表示存在 显著性差异(P<0.05);图2、图3同。

2.1.2 发酵温度的确定 植物乳杆菌LJ26在不同温度下生长情况呈现先增加后减少的趋势,在37 ℃左右生长时,其活菌数可达1×109cfu/mL,因此选择34～40 ℃进行后续研究。此外,在本研究选择的5个温度梯度内植物乳杆菌LJ26均可正常生长,活菌数可达到1×108cfu/mL以上,证明了植物乳杆菌LJ26良好的温度耐受性。

图2 发酵温度对活菌数的影响Fig.2 Selection of fermented temperature

2.1.3 发酵时间的确定 由图3可知,在本研究选择的5个发酵时间中,发酵12 h蓝莓果汁中的活菌数达1×108cfu/mL以上。发酵24 h时活菌数达到峰值(9.25lg cfu/mL),继续进行发酵,活菌数则会出现下降现象。过长的发酵时间不符合生产工艺的实际需求,因此应将发酵时间维持于24 h左右,因此选择12～36 h进行后续研究。

图3 发酵时间对活菌数的影响Fig.3 Selection of fermented time

2.1.4 响应面优化发酵工艺优化结果 根据Box-Benhnken试验设计进行响应面优化试验,结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiments

根据回归模型方差分析,得感官评价分数对自变量发酵温度(A)、发酵时间(B)及发酵剂起始量(C)的二次多项回归方程为:

Y=91.50+1.53A-0.76B+0.31C+0.75AB-2.60AC-3.07BC-5.64A2-14.51B2-4.11C2

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

图4 响应面试验交互作用Fig.4 Interaction results of surface response

2.2 功能性物质的含量

加工工艺中温度和pH的变化往往会导致植物源性的功能活性物质损失,因此本研究选择蓝莓中含丰富的酚类和花青素等功能性物质含量为研究指标,探究植物乳杆菌LJ26对蓝莓果汁中功能性物质含量的影响。酚类物质含量的测定首先进行标准曲线的绘制。本研究选择使用没食子酸作为标准参照,所得标准曲线方程为y=0.0932x+0.0096,相关系数R2=0.9982,满足后续实验要求。

进行发酵后,将实验组(发酵蓝莓果汁)与对照组(未蓝莓果汁)进行酚类物质含量检测。试验结果如表5。

表5 发酵前后功能物质比较Table 5 Comparison of functional substances before and after fermentation

试验结果发现,利用植物乳杆菌LJ26发酵蓝莓果汁,蓝莓果汁在发酵后其酚类物质含量显著增加(P<0.05)。利用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌及干酪乳杆菌对桑葚果汁进行发酵,其试验结果变化趋势与本研究试验结果基本一致。酚类物质增加的原因可能是因为在乳酸菌发酵过程中,其代谢过程可以将糖基化的酚类物质去糖基化,从而释放出小分子酚类物质[18]。Filannino等利用植物乳杆菌能够将樱桃汁中的原儿茶酸分解为邻苯二酚[19]。另一研究中发现植物乳杆菌可将黄酮苷转化为相应的糖基配体[20]。并且乳酸菌发酵导致的pH变化也会引起酚类物质的结构变化[21]。但在另外一些研究中却发现利用乳酸菌发酵果汁的过程中酚类物质含量反而会减少[22-23]。就目前的不同研究分析表明,底物基质、发酵工艺及发酵菌株间均存在一定差异,因此,菌株发酵对植物源性的酚类物质影响原理仍需研究。花青素作为一种黄酮类抗氧化剂广泛的应用于医疗保健,食品营养添加剂等领域中,但其稳定性极差,极易受温度、pH甚至光照等外界环境影响而导致降解[24]。在大量的发酵果蔬研究中,发酵后花青素含量都会产生一定程度的降解[25-26],而在本研究中,发酵后蓝莓果汁中的花青素含量存在显著性增长。E Kwaw等[18]利用三种乳酸菌对桑葚果汁进行发酵,其试验结果发现发酵后果汁中花青素含量有显著性的提高。目前虽无法确定导致花青素等黄酮类物质含量变化的原因,但乳酸菌发酵对于花青素的保护作用是不容置疑的,乳酸菌发酵可以维持底物基质中的酸性环境,这对于酚类物质以及花青素都有着积极的保护作用[27-28]。

2.3 抗氧化能力比较

2.3.1 体外抗氧化能力比较 由于DPPH自由基纯物质呈深紫色,具有单电子结构,自由基清除物质结合其单电子导致其显色降低,利用这一原理对其清除率进行检测。而超氧阴离子自由基能够将NBT还原为紫色的甲瓒[29],其在560 nm处具有最强吸收峰,因此,在反应过程中加入果汁或发酵果汁可以降低甲瓒的生成,从而获得果汁及发酵果汁超氧阴离子自由基清除率[29]。如图5所示,实验组的两种自由基清除率都高于对照组,且均存在显著性差异,对照组的DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除率为72.21%和32.57%,发酵后提高为87.32%和43.73%,显示出了植物乳杆菌发酵对蓝莓果汁抗氧化能力的增强。Mousavi等[29]利用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵石榴果汁发现,植物乳杆菌能够有效的提高石榴果汁的DPPH自由基清除能力;Park等[30]也发现经乳酸菌发酵后混合浆果汁的抗氧化能力显著增强。分析其机理,首先是由于乳酸菌对果蔬基质中天然功能活性物质的转化,使大分子物质转化为小分子,增强了抗氧化活性[29-30];其二是因为一些乳酸菌自身能够产生胞外多糖,这一类多糖能够通过自身结构特性清除自由基带来的氧化损伤[31]。

图5 没食子酸标准曲线Fig.5 Gallic acid standard curve

2.3.2 氧化损伤缓解能力比较 首先选择不同浓度的H2O2构建氧化损伤模型,结果如图6所示。随H2O2浓度升高,细胞存活率呈现先升高后降低的趋势。当H2O2浓度较低时,细胞的存活率有一定程度的升高,这证实了较轻程度的氧化应激反应会刺激细胞增殖[32]。在本研究中为满足后续试验要求,需要细胞维持单层贴壁状态,而较高浓度的H2O2则会导致细胞脱壁,导致细胞大量死亡,因此一般选择细胞存活率为95%时的H2O2浓度作为氧化损伤模型的构建浓度[33]。因此根据试验结果,选择500 μmol/L的H2O2进行后续试验。

图6 体外抗氧化能力比较Fig.6 Comparison of antioxidant capacity in vitro注:*：表示发酵前后同一自由基清除能力 存在显著性差异(P<0.05)。

图7 氧化损伤模型H2O2浓度选择Fig.7 Oxidative damage model H2O2 concentration 注:*表示与0 μmol/L H2O2组存在显著性差异(P<0.05)。

氧化损伤模型构建后进行发酵前后氧化损伤修复能力的比较试验,结果如表6所示。氧化损伤处理后,损伤组的SOD活性和GSH含量显著降低(P<0.05),再一次验证了氧化损伤模型成功构建。与损伤组相比,阳性对照组、未发酵蓝莓果汁组和发酵蓝莓果汁组的SOD活性均有显著性升高(P<0.05),证明了VC、未发酵蓝莓果汁和发酵蓝莓果汁对氧化损伤的改善作用。未发酵蓝莓果汁组与发酵蓝莓果汁组间也存在显著性差异,且发酵蓝莓果汁组的SOD活性与空白组基本持平,证明了发酵蓝莓果汁对氧化损伤的更有效的缓解作用,同时也证明了植物乳杆菌LJ26发酵对蓝莓果汁氧化损伤缓解能力的增强。另外在GSH含量的检测中,所有组别间都存在显著性差异(P<0.05)。相较于空白组,除损伤组GSH含量显著降低外(P<0.05),其余组别GSH含量都显著(P<0.05)升高。比较未发酵蓝莓果汁组和发酵蓝莓果汁组,经发酵蓝莓果汁处理的细胞GSH含量提高达87.16%,未发酵蓝莓果汁则提高45.52%,这一结果证明了植物乳杆菌LJ26发酵蓝莓果汁能够有效地提高其抗氧化能力,修复氧化应激带来的损伤。

表6 不同组抗氧化酶活性Table 6 Antioxidant enzyme activities of different group

3 结论

本研究选择植物乳杆菌LJ26对蓝莓果汁进行发酵,利用Box-Benhnken试验设计确定最佳发酵工艺:发酵温度37 ℃、发酵时间24 h和发酵剂起始量3%。在此条件下进行发酵,活菌数可达1×109cfu/mL以上。此外,在对蓝莓果汁发酵前后的功能活性物质含量结果表明,发酵后酚类物质含量和花青素含量均显著增加。抗氧化能力结果表明,发酵后蓝莓果汁的抗氧化能力显著提升,DPPH自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率可达87.32%和43.73%。细胞试验中,发酵蓝莓果汁的SOD活性和GSH含量明显提高,能有效缓解H2O2造成的氧化损伤,证明了植物乳杆菌LJ26能够显著提升蓝莓果汁抗氧化能力。但对功能物质含量变化仍可继续深入,可利用高效液相色谱、红外光谱和拉曼光谱等其他技术进一步分析其种类变化和变化机理。综上所述,本研究植物乳杆菌发酵的蓝莓果汁为蓝莓产业提供了新的产品类别,对蓝莓深加工技术提供了新的思路。