黑木耳多糖的磷酸化修饰及其抗氧化活性研究

郑常领,赵柄舒,王玉华,于寒松,张永生,刘俊梅,*

(1.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118; 2.吉林华鑫菌业有限责任公司,吉林舒兰 132600)

黑木耳(Auriculariaauricula)是我国珍贵的食用菌之一[1],东北地区资源丰富,其含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和微量元素等[2],并且还拥有极为丰富的多糖成分[3]。随着近年来研究的深入,已发现木耳多糖具有抗氧化[4-5],抗癌[6],抗凝血[7]以及降低胆固醇[8]等多种功能活性。作为一种天然活性物质,黑木耳多糖成了食品、医药等领域的研究热点。

多糖的生物活性取决于聚合物的分子性质,如单糖的分子量,链的构象,支链聚合的程度和糖苷键的类型等[9],研究发现,合理的多糖化学修饰有利于提高多糖的生物活性,如抗氧化[10],抗衰老[11],抗病毒[12]等。多糖的化学修饰方法主要包括磷酸化、乙酰化、硫酸化等[13],其中磷酸化修饰是多糖支链结构中羟基被游离的磷酸根基团所取代的过程[10]。近年来,不少科研人员已经发现磷酸化修饰后的多糖抗氧化活性显著提高,如Yuan等[14]的研究表明,磷酸化修饰显著提高了卡拉胶低聚糖清除DPPH自由基及羟基自由基的能力,表明多糖的抗氧化活性经磷酸化修饰后被提高;南征[15]发现磷酸化修饰显著增强了杏鲍菇多糖超氧阴离子及羟基自由基的清除能力;Li等[16]报道了采用不同的化学修饰对芍药多糖的抗氧化活性的影响,结果显示,在羟基自由基清除能力上磷酸化表现出较其他修饰方法更高的清除率,同时也证明了磷酸化修饰能提高多糖的抗氧化活性。虽然磷酸化修饰在理论上可以提高多糖的抗氧化活性,但目前还没有针对磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性研究的报道。因此,本研究对黑木耳胞外多糖进行磷酸化修饰,并且通过测定其对DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基的清除能力来评价磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性,以期为黑木耳多糖的深加工和新型功能性食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑木耳菌种(HX01) 由吉林华鑫菌业有限责任公司提供;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、水杨酸、邻苯三酚 美国Sigma公司;磷酸二氢钾(KH2PO4)、三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,STPP)、三偏磷酸钠(sodium trimetaphosphate,STMP)、浓硫酸、浓硝酸、Tris、钼酸铵、无水乙醇 以上试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;液体发酵培养基 葡萄糖20 g/L,马铃薯浸提液200 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO40.5 g/L,VB10.05 g/L,灭菌后备用。

FDU-7006型真空冷冻干燥机 韩国Operon公司;IR-Prestige-21型FTIR光谱仪 日本Shimadzu公司;UV-1700型酶标仪 日本Shimadzu公司;DDS-11A型台式电导率仪 上海贝威科技有限公司;AVY220型分析天平 Mettler Toledo公司;HH:SY11-Ni型恒温水浴箱 北京长丰仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑木耳多糖的制备 参照刘俊梅等[17]的方法,略作修改。无菌条件下,取直径约1 cm2的保存于斜面的种子菌丝块,接种于装有100 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中,28 ℃,150 r/min的条件下揺瓶发酵5 d,得到液体种子。将液体种子按10%的接种量接种于装有100 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中,于28 ℃,150 r/min 的条件下液态深层发酵5 d,得到液态深层发酵液。液态深层发酵液于5000 r/min离心10 min后收集上清液。上清液浓缩至原体积的1/5倍后,以三倍浓缩液体积的95%乙醇沉淀24 h,之后经真空冷冻干燥得到黑木耳多糖粗品。将粗多糖在60 ℃水浴中复溶,通过Sevage法除蛋白,H2O2脱色,然后利用透析袋透析除盐处理后得到黑木耳多糖纯品(AAP)。

1.2.2 黑木耳多糖的磷酸化 参照Ye等[18]的方法,略作修改。称取磷酸化试剂7 g(STPP 5 g+STMP 2 g),溶解于蒸馏水中,定容至100 mL,配制为70 mg/mL的磷酸化试剂。定容后加入AAP 1 g,硫酸钠5 g,溶解后调节pH至9.0,80 ℃条件下反应5 h。反应结束后,三倍体积的95%乙醇沉淀24 h。5000 r/min离心10 min去除乙醇,将沉淀样品真空冷冻干燥。冻干样品在60 ℃复溶,复溶样液于截流分子量为8000～14000 Da的透析袋中透析[19],检测样液中的电导率,当电导率降至160 μS/cm时,结束透析。透析后,样品浓缩至原体积的1/5倍,浓缩样品经三倍体积的95%乙醇沉淀24 h,除去乙醇后冻干样品即为磷酸化黑木耳多糖(P-AAP)。

1.2.3 磷酸根含量的测定 磷酸根含量的测定采用钼蓝比色法[20],以10 μg/mL的KH2PO4为磷酸根标准物。在试管中分别取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 mL磷酸根标准溶液,用去离子水定容至5 mL。依次添加1 mol/L的Tris 3 mL,20% VC水溶液1 mL,3 mol/L 硫酸溶液1 mL,3%的钼酸铵溶液1 mL,之后在30 ℃的恒温条件下反应30 min,测定样品溶液于580 nm波长处的吸光度。绘制标准曲线。

磷酸化黑木耳多糖中磷酸根的测定:在烧杯中取0.5 g均匀的样品,依次加入浓硫酸、浓硝酸各1 mL，并在通风橱中加热以产生白烟。冷却至室温,之后加入1 mL 30% H2O2,再次加热,重复上述操作直至不产生白烟,以完全分解有机物。加入浓度为1 mL的6 mol/L HCl并加热以分解酸。在进行测定时,取5 mL样液通过标准曲线方法测定,并计算多糖中的磷酸根含量(以P计)。

1.2.4 黑木耳多糖磷酸化修饰的单因素实验

1.2.4.1 磷酸化试剂(STPP与STMP质量比) 磷酸化试剂通常由STPP及STMP组成,浓度为70 mg/mL磷酸化试剂更利于磷酸化修饰多糖[21],本实验选用STPP及STMP质量比分别为0∶7、1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1的磷酸化试剂,在反应温度80 ℃,pH=8.0的条件下反应5 h后通过钼蓝比色法测定其磷酸根含量,研究不同STPP与STMP质量比的磷酸化试剂对P-AAP中磷酸根含量影响。

1.2.4.2 反应时间 选用STPP及STMP质量比为5∶2的磷酸化试剂,在80 ℃和pH=8.0的条件下,分别反应2、3、4、5、6 h,研究不同反应时间对P-AAP磷酸根含量的影响。

1.2.4.3 反应温度 选用STPP及STMP质量比为5∶2的磷酸化试剂,分别在60、70、80、90、100 ℃,pH8的条件下反应5 h。研究不同的温度对P-AAP中磷酸根含量的影响。

1.2.4.4 反应pH 选用STPP及STMP质量比为5∶2的磷酸化试剂,在反应温度80 ℃,pH分别为6、7、8、9、10的条件下反应5 h,探究不同反应pH对P-AAP中磷酸根含量的影响。

1.2.5 响应面法优化磷酸化条件 在单因素实验确定各因素取值范围的基础上,利用Box-Benhnken中心组合试验设计原则。使用P-AAP中磷酸根的含量作为响应值,以磷酸化试剂中STPP质量(g),反应时间(h),反应温度(℃),反应pH为独立变量,设计四因素三水平响应面分析试验,以确定磷酸化修饰的最优工艺条件,响应面试验设计因素表见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Levels and factors of Box-Benhnken design

1.2.6 磷酸化黑木耳多糖的分离纯化 多糖在进行抗氧化试验之前有必要对其进行二次纯化,以排除其他因素对抗氧化试验结果的影响[22],因此本试验对磷酸化多糖P-AAP先后通过DEAE-Sepharose Fast Flow柱以及Sephadex G-100柱进行分离纯化,以提高磷酸化多糖抗氧化试验结果的准确性。

1.2.6.1 DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱分离纯化 取磷酸化多糖P-AAP 5 mg,溶于5 mL蒸馏水中,加入到DEAE-Sepharose Fast Flow柱(1.6 cm×30 cm)中,以0、0.1、0.3、0.5、1 mg/mL的NaCl 溶液梯度洗脱,流速为1 mL/min。逐管收集洗脱液,每管收集5 mL,苯酚硫酸法检测多糖含量,并绘制曲线。

收集到的不同多糖洗脱液组分,经浓缩,冷冻干燥后得到磷酸化多糖的各个组分。

1.2.6.2 葡聚糖凝胶G-100柱纯化 取1.2.6.1中收集到的组分5 mg,溶于5 mL蒸馏水中,加入到Sephadex G-100柱(1.6 cm×30 cm)中,以蒸馏水进行洗脱,流速为0.5 mL/min,每管收集3 mL,苯酚硫酸法检测多糖含量,并绘制曲线。收集到的多糖洗脱液,经浓缩,冷冻干燥后得到磷酸化多糖组分。

1.2.7 红外光谱分析 使用FTIR光谱仪测定多糖的红外光谱。纯化后的P-AAP及AAP用光谱级KBr粉末以1∶200的比例研磨后压片,在4000～400 cm-1的波数范围内进行测量。

1.2.8 DPPH自由基清除能力试验 参照You等[23]的方法,略作修改。在比色管中添加3 mL的5 mmol/L DPPH-乙醇溶液,不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖样液1 mL。摇匀后,在黑暗中静置30 min。于517 nm处测定吸光值,记为A1;样品溶液用1 mL无水乙醇代替,517 nm处吸光值分别记为A0;用3 mL蒸馏水代替DPPH-乙醇溶液,517 nm处吸光值分别记为A2。VC作为参照物。按照式(1)计算多糖对DPPH自由基的清除率。

式(1)

1.2.9 羟基自由基清除能力试验 采用水杨酸法测定,参照Sun等[24]的方法,稍作修改。依次向比色管中加入9 mmol/L FeSO41 mL,9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL,不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖样液1 mL,加入8.8 mmol/L H2O21 mL后摇匀,在37 ℃下反应30 min,于510 nm处测定样液的吸光值,记为A1。用1 mL蒸馏水代替样液,记510 nm处吸光值为A0;用1 mL蒸馏水代替H2O2溶液,记517 nm处吸光值为A2。以VC为参照物。以公式(1)计算多糖对羟基自由基的清除率。

1.2.10 超氧阴离子自由基清除能力试验 采用邻苯三酚法[25]测定,在比色管中加入0.05 mol/L,pH7.4的Tris-HCl缓冲液3 mL,不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖样液1 mL,60 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL,快速混合,每隔30 s测定325 nm处吸光值,直至300 s,A0=A300 s-A30 s;以1 mL蒸馏水替代样液,325 nm处吸光值,A1=A300 s-A30 s。以VC为参照物。按照式(2)计算多糖对超氧阴离子自由基的清除率。

式(2)

1.3 数据处理

本实验所有实验数据均重复测定三次,采用Origin 2017软件作图分析结果,利用Design Expert 8.0.6软件设计响应面实验并分析数据,采用SPSS 22软件进行数据统计学分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 磷酸化试剂对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响 以黑木耳胞外多糖中磷酸根含量作为磷酸化修饰程度的评价指标,磷酸根含量越高表示磷酸根基团接枝率越高,修饰程度也越高[26]。由表2可知,单独使用STPP或STMP的磷酸化试剂后多糖的磷酸根含量均不及二者复合使用时磷酸根的含量,说明反应中二种试剂相互影响,使多糖中磷酸根含量发生变化。磷酸化试剂中STPP质量在1～5 g的范围内时,随着STPP质量的增加,磷酸根的含量呈上升趋势,当磷酸化试剂中STPP质量达到5 g时,磷酸根含量达到最大值,为7.94%。随后当磷酸化试剂中STPP质量为6 g时磷酸根含量呈下降趋势,因为磷酸化试剂中STPP质量达到一定值后会导致黑木耳多糖结构的破坏[27],从而影响多糖中磷酸根的含量。因此,选择磷酸化试剂中STPP质量为5 g进行响应面试验。

表2 磷酸化试剂对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响Table 2 Effect of phosphorylation reagents on the content of phosphate group in AAP

2.1.2 反应时间对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响 由图1可知,反应时间在2～5 h范围内时,随反应时间的延长,磷酸根的含量呈现上升趋势,其中反应时间为5 h时,黑木耳多糖磷酸根含量达到最大值,为8.02%。但当时间达到6 h时,磷酸根的含量有所下降,这是由于高温下长时间反应对多糖结构有所破坏,导致磷酸根含量降低[28]。因此,选择反应时间为5 h进行响应面试验。

图1 反应时间对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响Fig.1 Effect of reaction time on the content of phosphate group in AAP

2.1.3 反应温度对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响 从图2可以看出,在温度为60～100 ℃范围内时,温度升高,磷酸根含量增加,在90 ℃达到最大值，为8.19%。然而,当温度进一步升高时,由于过高的温度导致多糖结构的破坏,从而磷酸根含量降低[28]。因此,选择反应温度为90 ℃进行响应面试验。

图2 反应温度对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on the content of phosphate group in AAP

2.1.4 反应pH对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响 由图3可知,碱性条件下对于磷酸根接枝于黑木耳多糖的结构上更加有利,因为糖苷键在酸性条件下容易水解,多糖降解严重[29-30]。pH在6.0～9.0时,磷酸根含量逐渐上升,其原因是因为碱性条件下更利于磷酸根的接支作用。当pH为9.0时,磷酸根含量达到最大值,为8.15%。但当pH继续升高时,磷酸根含量呈现下降趋势,这是由于过高的碱性环境会抑制磷酸化试剂的接枝作用所造成的[31]。因此,选择反应pH为9.0进行响应面试验。

图3 反应pH对黑木耳多糖中磷酸根含量的影响Fig.3 Effect of pH on the content of phosphate group in AAP

2.2 响应面法优化黑木耳多糖磷酸化修饰条件的结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 在单因素优化试验的基础上,以磷酸化试剂中STPP的质量、反应时间、反应温度以及反应pH为自变量,黑木耳多糖中磷酸根含量作为响应值,设计四因素三水平响应面分析试验,试验方案设计及结果见表3。

表3 磷酸化修饰参数响应面方案设计及结果Table 3 Optimization of response surface analysis and design of phosphorylated conditions

2.2.2 回归模型方差分析 回归模型方差以及显著性分析的结果如表4所示。

表4 回归模型的方差分析数据Table 4 Variance analysis data of regression model

Y=-304.00333+9.63583A+3.59982B+21.63317C+15.00583D-3.5×10-3AB+0.105AC-0.4275AD-0.04375BC-5.5×10-3BD+0.215CD-0.81925A2-0.018018B2-1.12175C2-1.40925D2

由表4可知,因素中一次项 B、C,二次项 A2、B2、C2、D2对磷酸根含量具有极显著的影响,表明各因素与响应值之间不是简单的线性关系,其中AD、BC对磷酸根含量影响显著。

2.2.3 响应面分析与优化 各因素以及两两因素之间交互作用对响应值的影响情况可以直观地从响应面图形中反映出来[32]。如图4、图5显示了黑木耳多糖磷酸根含量的3D响应面图及等高线图。

图4 STPP质量及反应时间对磷酸根含量的影响Fig.4 Effect of STPP addition and reaction time on the content of phosphate group

图5 反应pH及反应温度对磷酸根含量的影响Fig.5 Effect of pH and reaction temperature on the content of phosphate group

由图4～图5可以看出,磷酸化试剂中STPP质量与反应时间以及温度与pH之间有交互作用。且图4～图5中响应面图形开口向下,有最大值,表明此模型可进行最优结果分析。通过软件优化,以磷酸根含量为指标,得到磷酸化修饰黑木耳多糖的工艺参数为磷酸化试剂中STPP质量为4.93 g,反应温度88.16 ℃,反应时间5.06 h,反应pH为8.64,磷酸根含量预期值为9.84%。考虑到实际条件,参数确定为磷酸化试剂中STPP质量为5 g,STMP质量2 g,反应温度88 ℃,反应时间5 h,反应pH为8.6。在当前条件下,对AAP进行磷酸化修饰,测得磷酸根含量为(9.93%±0.21%,n=3),与预期值接近,说明该模型可应用于磷酸化修饰黑木耳多糖。

2.3 磷酸化多糖的分离纯化结果

如图6,磷酸化黑木耳多糖P-AAP经DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析,分别于蒸馏水以及0.1 mol/L的NaCl两个洗脱溶液处得到了2个洗脱峰。由于第二个峰不易收集,所以对第一个峰收集,之后经浓缩,真空冷冻干燥,命名为P-AAP1,进行下一步试验。

图6 磷酸化多糖P-AAP的DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱曲线Fig.6 Chromatography of P-AAP on DEAE-Sepharose Fast Flow

如图7,P-AAP1经Sephadex G-100柱纯化后,在蒸馏水的洗脱下得到一个单一对称峰,表明该多糖组分无其他杂质,P-AAP1磷酸化多糖组分经浓缩,真空冷冻干燥后进行下一步试验。

图7 磷酸化多糖P-AAP1的Sephadex G-100洗脱曲线Fig.7 Chromatography of P-AAP1 on Sephadex G-100

2.4 磷酸化黑木耳多糖的红外光谱分析结果

AAP及P-AAP1在4000～400 cm-1波数范围内的红外光谱图结果如图8所示。

图8 黑木耳多糖AAP及磷酸化黑木耳多糖P-AAP1的红外光谱图Fig.8 Infrared(IR)analysis of AAP and P-AAP1

该吸收峰为典型的多糖吸收峰并且磷酸化前后峰型未发生较大变化,说明多糖的主体结构没有变化[33]。P-AAP1和AAP在3336 cm-1处的吸收峰为-OH的伸缩振动吸收峰,表明P-AAP1和AAP中含有分子内氢键[34];2931、1417 cm-1处为C-H的伸缩振动吸收峰,为糖类的特征吸收峰[35];其中1668 cm-1处的吸收峰是羰基C=O键的吸收峰;1021 cm-1处的吸收峰表明P-AAP1和AAP为吡喃糖[36]。除此之外,P-AAP1在1215 cm-1处的吸收峰为P=O键的伸缩振动吸收峰,903 cm-1处的吸收峰为P-O-C键的吸收峰[37],这两个峰的变化表明有磷酸基团接入。综上,磷酸化修饰黑木耳多糖成功,所得产物为磷酸化黑木耳多糖。

2.5 磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性分析结果

2.5.1 DPPH自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的DPPH自由基的清除率结果如图9所示。

图9 磷酸化黑木耳多糖的DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of DPPH radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由图9可知,P-AAP1在一定浓度范围内,浓度与清除率呈现量效关系,并且浓度越高,多糖对DPPH自由基的清除率越高。在浓度为5 mg/mL时,P-AAP1和AAP的清除率分别为87.97%、53.60%,P-AAP1较AAP的清除率提高了34.37个百分点,说明磷酸化修饰提高了黑木耳多糖清除DPPH自由基的能力。更低的半抑制浓度IC50值反应了更强的清除自由基能力[38],P-AAP1、AAP及VC的IC50值分别为1.07、3.14、0.19 mg/mL,P-AAP1的IC50值虽高于VC,但低于AAP,说明磷酸化修饰可以提高黑木耳多糖清除DPPH自由基的能力。Deng等[39]证明了大型真菌竹荪中的多糖,经磷酸化修饰后提高了多糖对DPPH自由基的清除能力,并且同样拥有剂量依赖性。

2.5.2 羟基自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的羟基自由基的清除率结果如图10所示。

图10 磷酸化黑木耳多糖的羟基自由基的清除率Fig.10 Scavenging rate of hydroxyl radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由图10可知,P-AAP1和AAP对羟基自由基都有的清除作用,并且反映出清除率对多糖浓度具有依赖性。在浓度为5 mg/mL时,P-AAP1和AAP的清除率分别为86.63%、56.24%,P-AAP1较AAP的清除率提高了30.39个百分点,表明磷酸化修饰后对羟基自由基的清除作用有所提高。P-AAP1的IC50值为0.91 mg/mL,高于VC的IC50值0.42 mg/mL,但低于AAP的IC50值3.34 mg/mL,说明黑木耳多糖经磷酸化修饰后可以有效的提高其清除羟基自由基的能力。Guo等[40]对乳酸乳球菌的胞外多糖进行磷酸化修饰后证明了同样的结论。

2.5.3 超氧阴离子自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的超氧阴离子自由基的清除率结果如图11所示。

图11 磷酸化黑木耳多糖的超氧阴离子自由基的清除率Fig.11 Scavenging rate of superoxide anion radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由图11可知,P-AAP1对超氧阴离子自由基的清除能力在浓度的增加的同时呈现上升趋势,在浓度为5 mg/mL时,P-AAP1和AAP的清除率分别为81.26%、54.86%,P-AAP1较AAP的清除率提高了26.40个百分点,表明磷酸化修饰后提高了黑木耳多糖对超氧阴离子自由基的清除率。P-AAP1、AAP和VC的IC50值分别为0.41、2.24、0.12 mg/mL,P-AAP1的IC50值虽高于VC的IC50值,但相对于AAP的IC50值明显降低,表明磷酸化修饰可以提高黑木耳多糖清除超氧阴离子的能力,而且与其他两种自由基清除能力相比,P-AAP1对超氧阴离子自由基的清除能力,表现的更突出。孙婕等[41]对南瓜多糖磷酸化修饰后也证明了同样的结论,即磷酸化后的多糖具有对超氧阴离子更强的清除能力。

3 结论

通过单因素与响应面试验优化后,得到磷酸化修饰黑木耳多糖的最优工艺参数,在最优工艺参数下多糖中磷酸根含量为9.93%,与模型预期值9.84%接近。红外光谱试验结果显示磷酸化修饰前后多糖的主体结构未发生变化,并且多糖结构中有磷酸基团的出现,说明磷酸化修饰成功。抗氧化活性试验结果表明,P-AAP1较AAP具有更强的抗氧化活性。其中P-AAP1在浓度为5 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率为87.97%,IC50值为1.07 mg/mL;浓度为5 mg/mL时,对羟自由基的清除率为86.63%,IC50值为0.91 mg/mL;浓度为5 mg/mL时,对超氧阴离子自由基的清除率为81.26%,IC50值为0.41 mg/mL。本试验中三种自由基清除率均提升,IC50值均降低,说明通过磷酸化修饰的方法能够提高黑木耳多糖的抗氧化活性。

多糖的抗氧化活性是因其含有的羟基和糖蛋白复合物而产生的,黑木耳多糖经过磷酸化修饰后其分子结构发生了衍生,从而生物活性发生改变,进一步影响黑木耳多糖的抗氧化活性。也有学者认为多糖经化学修饰,化学基团取代多糖上的羟基后,结构发生变化,更多的羟基被暴露从而抗氧化活性增强。但目前磷酸化黑木耳多糖的抗氧化作用机理还不明确,仍需进一步探讨研究。