响应面优化二阶段法粗糙脉孢菌发酵产番茄红素工艺

阙发秀,陈 钢,郭月山,郑淑丹,简素平,万 聆

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

番茄红素(lycopene)是一种具有11个共轭双建的β-类胡萝卜素,具有强抗氧化性[1-2]。同时,番茄红素能够降低胃癌[3]、宫颈癌[4]、皮肤癌[5]等癌症的风险,具有抗突变等作用[6],在食品、医药和化妆品等行业具有重要的应用价值。

粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)营养要求低、菌丝生长快。目前,利用粗糙脉孢菌液体摇瓶发酵所产番茄红素产量较低[7],虽然李陈陈等[8]通过固态发酵能显著提高番茄红素的产量,但是关于固态发酵的可用生物反应器设计较少[9],很难实现扩大培养。粗糙脉胞菌产生的番茄红素主要集中于分生孢子中[10-11]。液体摇瓶培养对丝状真菌气生菌丝分化产生分生孢子有抑制和延迟作用[12],虽然菌丝暴露于空气中时能诱导菌丝产孢[13],但菌丝必须经过一段时间的生长后才能获得应答外界诱导信号的能力[14]。二阶段培养是通过摇瓶培养让菌丝经过一段时间的生长后,再通过静止培养让菌丝漂浮于液面上接触空气产生气生菌丝进行诱导产孢的一种方法。研究报道,二阶段培养法能显著提高孢子产量和相应的代谢产物[15]。

本试验研究了二阶段培养法对粗糙脉孢菌发酵产番茄红素的影响和通过优化发酵条件提高了番茄红素的产量,为微生物液体发酵产番茄红素和孢子内代谢产物的工业生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)3.1607 本实验室-4 ℃冰箱保藏;番茄红素标品 纯度≥98%,美国Sigma公司;二氯甲烷、乙腈(色谱纯)、乙酸乙酯、丙酮 分析纯,天津恒兴化学试剂制造有限公司;葡萄糖、蛋白胨、NaNO3、MgSO4、KCl、FeSO4、K2HPO4分析纯,天津市大茂试剂厂;种子培养基 PDA培养基;发酵培养基 取一定质量含54.54%葡萄糖、36.36%蛋白胨、0.91% MgSO4、0.91% KCl、0.02% FeSO4、5.45% NaNO3、3.0% K2HPO4的培养基加蒸馏水配成不同浓度的发酵培养基,自然pH,121 ℃灭菌20 min。

ZHP-160型智能恒温振荡培养箱 上海三发科学仪器有限公司;TG16-WS型台式高速离心机 湖南湘实验室仪器开发有限公司;GXD系列型自动恒温鼓风干箱 上海红联机械电器制造有限公司;Agilent1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;SW-CJ-1B标准净化工作台 苏州净化仪器厂;SB-5200DT型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养 将菌种置于PDA斜面培养基30 ℃活化培养48 h之后,挑取4环菌种接种到装有60 mL蒸馏水的250 mL锥形瓶中混匀,然后按5%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中,于30 ℃摇瓶(100 r/min)培养24 h后静止培养84 h。发酵结束后用蒸馏水洗涤抽滤菌体,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,称其菌体干质量。

1.2.2 番茄红素的提取与测定

1.2.2.1 番茄红素的提取 将烘干后的菌体转移至研钵中,加入适量的石英砂,充分研磨后加入10 mL体积比为2∶3的乙酸乙酯-丙酮混合液,超声波处理20 min(200 W,25 ℃)后暗室提取2.5 h,经0.22 μm微孔滤膜过滤,得到色素浸提液,每组做3个平行,HPLC检测番茄红素含量[16]。

1.2.2.2 高效液相色谱色谱条件 色谱柱为Agilent Ecllpse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm);Binary高效泵;流动相为乙腈-二氯甲烷(60∶40,V/V);检测波长为472 nm;流速为1.0 mL/min;柱温28 ℃;进样量10 μL[17]。

1.2.2.3 番茄红素标准曲线制作 精密称取1 mg的番茄红素标准品,用乙酸乙酯-丙酮2∶3 (V/V)溶液溶解,定容于10 mL的棕色容量瓶中,得到质量浓度为100 μg/mL的溶液。逐级稀释为0、20、40、60、80、100 μg/mL的番茄红素标准溶液[18]。在“1.2.2.2”色谱条件下测定番茄红素的峰面积,根据番茄红素标准品的保留时间作定性分析,以各浓度为纵坐标(Y),峰面积为横坐标(X)进行线性回归计算,得番茄红素标准品回归方程:y=24.246x+51.938(R2=0.9988)。

1.2.2.4 番茄红素产量的计算

式中:y表示样品中番茄红素的峰面积,v1为浸提液体积,v2为发酵液体积。

1.2.3 单因素实验设计 预实验中,研究了培养基浓度、摇瓶培养时间、静止培养时间、接种量、温度、摇瓶速率6个因素对番茄红素产量的影响,其中培养基浓度、摇瓶培养时间、静止培养时间、接种量是二阶段培养法过程参数中影响较为显著的因素。因此,本实验选取了以上4个因素进行单因素实验,实验平行3次,结果取平均值。

1.2.3.1 培养基浓度对番茄红素产量的影响 在摇瓶培养时间为18 h、静止培养时间为84 h、接种量5%的条件下,考察培养基浓度为11、22、33、44、55 g/L对二阶段培养粗糙脉孢菌发酵产番茄红素的影响。

1.2.3.2 摇瓶培养时间对二阶段培养粗糙脉孢菌番茄红素产量的影响 在培养基浓度为33 g/L、接种量5%、静止培养时间为84 h的条件下,考察摇瓶培养时间为12、18、24、30、36 h对二阶段培养粗糙脉孢菌发酵产番茄红素的影响。

1.2.3.3 静止培养时间对二阶段培养粗糙脉孢菌番茄红素产量的影响 在培养基浓度为33 g/L、接种量5%、摇瓶培养时间为18 h的条件下,考察摇瓶培养时间为60、72、84、96、108 h对二阶段培养粗糙脉孢菌发酵产番茄红素的影响。

1.2.3.4 接种量对二阶段培养粗糙脉孢菌番茄红素产量的影响 在培养基浓度为33 g/L、摇瓶培养时间为18 h、静止培养时间为84 h的条件下,考察接种量3%、4%、5%、6%、7%对二阶段培养粗糙脉孢菌发酵产番茄红素的影响。

1.2.4 响应面试验 在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken设计原理,以培养基浓度、摇瓶培养时间、静止培养时间和接种量为自变量,番茄红素产量为响应指标进行响应面设计,Box-Behnken试验因素与水平见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Code of factors and levels

1.2.5 二阶段培养法与摇瓶培养法对菌体干质量和番茄红素产量的影响

1.2.5.1 二阶段培养法对菌体干质量和番茄红素产量的影响 按5%的接种量接入装有50 mL 35 g/L的发酵培养基的250 mL三角瓶中,于30 ℃摇瓶(100 r/min)培养19 h后静止培养87 h。发酵结束后用蒸馏水洗涤抽滤菌体,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,称其菌体干质量和提取测定番茄红素的产量,记为二阶段培养法条件下菌体干质量和番茄红素产量。

1.2.5.2 摇瓶培养法对菌体干质量和番茄红素产量的影响 参照耿英龙等[7]的液体培养条件,按6.5%的接种量接入装有50 mL 55 g/L的发酵培养基的250 mL三角瓶中,于30 ℃摇瓶(100 r/min)培养110 h。发酵结束后用蒸馏水洗涤抽滤菌体,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,称其菌体干质量和提取测定番茄红素的产量,记为摇瓶培养法条件下菌体干质量和番茄红素产量。

1.3 数据分析

所得数据均为3次平行测定的平均值,采用Origin 8.5统计分析软件、Design Expert 8.0.6软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 培养基浓度对二阶段法培养粗糙脉胞菌发酵产番茄红素的影响 由图1可知,菌体干质量随着培养基浓度增大而增大,当培养基浓度大于44 g/L时,菌体干质量保持稳定。培养基浓度增大即营养物质的浓度增大促进了菌体的生长繁殖;当培养基浓度达到44 g/L以后,进一步增大培养基浓度对菌体干质量无影响。随着培养基浓度增大番茄红素的产量增大,当培养基浓度为33 g/L时番茄红素的产量达到最大。当超过33 g/L,番茄红素的产量呈下降趋势,可能是因为营养物质浓度较大,抑制了孢子的产生[12],导致番茄红素的产量下降。

图1 培养基浓度对菌体干质量和番茄红素产量的影响Fig.1 Effects of medium concentration on dry cell weight and lycopene production

2.1.2 摇瓶培养时间对二阶段法培养粗糙脉胞菌发酵产番茄红素的影响 由图2可知,菌体干质量随着摇瓶时间延长而增大,当摇瓶培养时间超过30 h时,菌体量较多发酵液粘稠,静止培养时发酵液中溶氧不足,菌体自溶导致菌体干质量下降。番茄红素产量随着摇瓶培养时间延长而增大,于18 h峰值为(18.65±0.24) mg/L。产孢是经过一段时间的营养生长才进行[14],当摇瓶时间较短时,菌体营养生长不足,可能导致番茄红素的产量较低。18 h后呈下降趋势,可能是因为随着摇瓶时间延长,总培养时间延长,番茄红素转换为代谢终产物β-胡萝卜素[19]。

图2 摇瓶培养时间对菌体干质量和番茄红素产量的影响Fig.2 Effects of shake culture time on dry cell weight and lycopene production

2.1.3 静止培养时间对二阶段法培养粗糙脉胞菌发酵产番茄红素的影响 由图3可知,静止培养时间对菌体干质量影响不大,主要是因为静止培养时发酵过程中的传质效果差。静止时间超过96 h,菌体干质量开始下降,可能因为菌体培养进入衰退期,菌体开始自溶。随着静止培养时间延长,番茄红素产量增大,于静止培养84 h产量最大,随后呈下降趋势,主要是因为番茄红素转换为代谢终产物β-胡萝卜素[19]。

图3 静止培养时间对菌体干质量和番茄红素产量的影响Fig.3 Effects of static culture time on dry cell weight and lycopene production

2.1.4 接种量对二阶段法培养粗糙脉胞菌发酵产番茄红素的影响 由图4可知,在接种量分别为5%和6%时,番茄红素产量和菌体干质量最大,菌体干质量和番茄红素产量均随接种量增大而增大,随后减小,可能是因为接种量大,菌体繁殖过快、过稠不利于番茄红素的产生,同时菌团悬浮于培养液中使下层培养基溶氧降低,进而影响菌体生长。

图4 接种量对菌体干质量和番茄红素产量的影响Fig.4 Effects of inoculum quantity on dry cell weight and lycopene production

2.2 响应面试验方案设计与结果分析

根据单因素实验结果,根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理,采用响应面分析法,以番茄红素产量为考察指标,利用 Design Expert 8.0.6软件在四因素三水平上对二阶段法培养粗糙脉孢菌产番茄红素的发酵条件中的影响因素:培养基浓度、摇瓶培养时间、静止培养时间、接种量进行优化,确定最佳的发酵条件。试验设计及结果见表2,方差分析结果见表3。

表2 Box-Behnken试验方案及试验结果Table 2 Experiment design and resultsTable of Box-Behnken

表3 方差分析结果表Table 3 Results of variance analysis

利用Design Expert 8.0.6软件对实验设计结果做回归分析,得到响应值番茄红素产量(Y)对编码自变量A、B、C和D的二元多项回归方程预测模型为:Y=19.72+0.62A+0.85B+1.05C+0.13D-0.57AB+0.075AC-0.087AD-0.11BC-0.25BD+0.045CD-1.9A2-2.27B2-2.03C2-1.05D2

2.2.1 各因素之间的交互作用 响应面图和等高线图可以形象地反映出各因素之间的相互作用和最佳参数。等高线图呈圆形说明两因素之间的交互作用不明显,呈椭圆形说明两因素之间的交互作用极为显著[20]。由图4a可知,培养基浓度在33～38.5 g/L,摇瓶培养时间在18～21 h时,番茄红素产量达到最高值,等高线图呈椭圆形,说明两者之间交互影响显著。由图4b可知,静止时间在84～90 h,培养基浓度在33～38.5 g/L时,番茄红素产量达到最高值,等高线图偏向圆形,说明两者之间交互影响不显著。由图4c可知,接种量在5%,培养基浓度在33～38.5 g/L时,番茄红素产量达到最高值,等高线图呈圆形,说明两者之间交互影响不显著。由图4d可知,摇瓶时间在18～21 h,静止时间在84～90 h时,番茄红素产量达到最高值,等高线图偏向圆形,说明两者之间交互影响不显著。由图4e可知,接种量在5%,摇瓶时间在18～21 h时,番茄红素产量达到最高值,等高线图偏向圆形,说明两者之间交互影响不显著。由图4f可知,接种量在5%,静止培养时间在84～90 h时,番茄红素产量达到最高值,等高线图偏向圆形,说明两者之间交互影响不显著。

2.2.2 最佳二阶段发酵条件的确定和验证 由Design Expert 8.0.6软件分析得最佳二阶段发酵条件为:培养基浓度34.57 g/L,摇瓶培养时间18.97 h,静止培养时间87.09 h,接种量5.04%,其理论番茄红素产量为19.97 mg/L。为了便于实际操作,将二阶段发酵条件修正为:培养基浓度35 g/L,摇瓶培养时间19 h,静止培养时间87 h,接种量5%,经三次重复试验验证后,得到番茄红素产量为(19.87±0.28) mg/L,与预测值之间没有显著差异。

2.3 二阶段培养法与摇瓶培养法对菌体干质量和番茄红素产量的影响

二阶段培养法采用上述最佳工艺发酵条件,摇瓶培养采用耿英龙等[7]研究的液态培养条件,从图5可知,相对传统摇床培养法,二阶段培养法降低了菌体的质量,但提高了番茄红素的产量。菌体干质量减少了23.54%,番茄红素的产量提高了102.54%,可见二阶段培养可以明显提高番茄红素的产量。

图5 番茄红素产量的响应面图Fig.5 Response surface stereogram of lycopene production

图6 二阶段培养法与摇瓶培养法对菌体干质量和番茄红素产量的影响Fig.6 Effects of two-stage culture and shake culture on dry cell weight and lycopene production

3 结论

利用响应面法建立了二阶段培养粗糙脉胞菌产番茄红素发酵工艺的二次项数学模型,通过方差分析模型显著,方程拟合度良好。影响二阶段培养粗糙脉胞菌发酵产番茄红素的各因素主次顺序为:静止培养时间>摇瓶培养时间>培养基浓度>接种量。最佳发酵工艺条件为:培养基浓度35 g/L,摇瓶培养时间19 h,静止培养时间87 h,接种量5%。在此条件下,相对传统摇床培养法,菌体干质量减少了23.54%,番茄红素的产量提高了102.54%。