酶法提取苦丁茶熊果酸的工艺优化及其对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用

张海全,钟晓坤,黄勤英,农克良

(广西民族师范学院 广西高校桂西南特色植物资源化学重点实验室,广西崇左 532200)

肝病是影响人类健康的疾病,但其预防和治疗仍存在局限性。对天然产物的活性成分开展研究以寻求安全有效的保肝功能性食品是食品领域研究的热点。熊果酸具有抗菌[1]、抗炎[2-3]、保肝[4-6]等作用,在食品、药品领域具有巨大的应用前景[7],未来可作为治疗和预防肝病的药物之一。文献报道苦丁茶中熊果酸含量高达2.78%[8],可作为熊果酸的重要来源。

张明等[9]利用纤维素酶酶解提取苦丁茶中的熊果酸,提取率为1.26%,较传统有机溶剂提取法高,表明酶解工艺可替代传统有机溶剂提取法。此外,微波及超声法[10]、超临界CO2萃取法[11]、分子印记固相萃取法[12]等亦可从苦丁茶中提取熊果酸。现有方法仍存在一定缺点,如溶剂消耗量大,提取过程复杂,条件苛刻等,故苦丁茶熊果酸的提取工艺仍需优化。酶法提取工艺具有效率高、条件温和、绿色环保等优点,适用于天然产物活性成分的提取,故可考虑酶法对苦丁茶熊果酸进行提取,并采用响应面法优化条件,以期找到最优工艺。

研究表明,苦丁茶提取物可有效抑制肝损伤[13],但作用机制尚未明确。苦丁茶熊果酸保肝作用研究鲜有报道,试验采用响应面法优化酶解提取苦丁茶熊果酸的工艺,并探讨熊果酸对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用,为开发苦丁茶作为保肝护肝保健品提供一定的理论依据,为苦丁茶熊果酸保肝药理作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物60只昆明种小鼠,4～5周龄,SPF级,雌雄各半,体重18～22 g,来源于广西医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(桂)2014-0001;苦丁茶 湘君大药房,经广西民族师范学院农克良教授鉴定为冬青科冬青属大叶冬青苦丁茶的干燥叶,粉碎过80目筛,备用;熊果酸标准品 广州分析测试中心;纤维素酶 南宁东恒华道生物科技有限责任公司;联苯双酯滴丸 广州白云山星群(药业)股份有限公司;谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒 南京建成生物工程研究所。

UV-6100S紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;分析天平 奥豪斯仪器有限公司;HH-S4型数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;GZX-GF101-1 BS型电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司;GMSP-5倒置显微镜 上海光学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 熊果酸标准曲线的绘制 以香草醛乙酸溶液和高氯酸为显色体系,采用紫外分光光度法于548 nm测定不同浓度熊果酸标准品的吸光度,建立熊果酸标准曲线,方程为Y=0.0242X+0.0078(R2=0.9971)。详细操作见参考文献[14]。

1.2.2 苦丁茶熊果酸的提取及测定 苦丁茶经粉碎过80目筛,以适量蒸馏水浸泡2 h,加入一定量纤维素酶在一定温度、pH下酶解一定时间。酶解完成后加热至100 ℃灭酶,减压抽滤,滤渣100 ℃烘干。苦丁茶滤渣以液料比为17∶1加入83%的乙醇回流提取1 h,抽滤,滤液减压浓缩,浓缩物于60 ℃下干燥12 h即得粗产品。

熊果酸含量的计算按下式:

其中:A为提取液的吸光度;V为提取液的体积,mL;N为提取液稀释的倍数;m为苦丁茶粉末的质量,g。

1.2.3 单因素实验 分别考察酶解pH、酶解时间、酶解温度、酶用量对熊果酸含量的影响。设定酶解时间1.0 h,酶解温度50 ℃,酶用量0.5 g,考察酶解pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5时对熊果酸含量的影响。设定酶解pH5.0,酶解温度50 ℃,酶用量0.5 g,考察酶解时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h时对熊果酸含量的影响。设定酶解时间1.0 h,酶解pH5.0,酶用量0.5 g,考察酶解温度为46、48、50、52、54 ℃时对熊果酸含量的影响。设定酶解时间1.0 h,酶解温度50 ℃,酶解pH5.0,考察酶用量为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g时对熊果酸含量的影响。

1.2.4 响应面优化试验 在单因素实验的基础上,结合相关研究报道[15-16],以纤维素酶进行试验,选取酶解温度、酶解pH、酶解时间为自变量,通过Design-Expert V8.0.6软件的Box-Behnken功能,采用三因素三水平响应面分析法优化酶解苦丁茶熊果酸的提取工艺,设计如表1。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 苦丁茶熊果酸供试品的精制 为获得精制的熊果酸进行保肝实验,粗产品按参考文献[14]的重结晶方式提纯,采用高效液相色谱法[17]分析纯度。

1.2.6 苦丁茶熊果酸对CCl4致肝损伤小鼠的保护作用 60只昆明小鼠随机分成6组,即正常组、模型组,联苯双酯组及熊果酸低、中、高剂量组,每组10只。熊果酸低、中、高剂量组小鼠灌胃给药剂量分别为15、30、60 mg/kg,联苯双酯组灌胃给药剂量为200 mg/kg,正常组和模型组小鼠给予等体积蒸馏水。给药7 d后[18],除正常组腹腔注射橄榄油外,其余各组小鼠腹腔注射0.1% CCl4橄榄油溶液20 mL/kg。随后禁食不禁水16 h,各组小鼠摘除眼球取血,3000 r/min离心10 min,取血清按照试剂盒说明检测ALT、AST水平。取血后解剖小鼠,取相同部位肝组织,用生理盐水制备10%的肝组织匀浆,3000 r/min离心10 min,

上清液按照试剂盒说明测定SOD、GSH-Px和MDA的含量;同时取肝右叶,10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片,HE染色后,观察肝组织的病理变化。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

由图1A可以看出酶解pH对苦丁茶熊果酸的含量影响较大,其随酶解pH先增大后减小,当酶解pH5.0时纤维素酶酶活力达到最大值,能够充分水解苦丁茶纤维,破坏细胞壁,充分释放细胞内的熊果酸,故含量达到最大值。pH过大或过小时其酶活性大大降低,甚至可能会引起部分酶失活,从而影响酶与底物的充分结合,使酶解效果下降,故选取pH5.0为酶解适宜的pH。

图1 单因素试验结果Fig.1 The results of single factor test

由图1B可知,随着酶解时间的增加苦丁茶熊果酸的含量先上升后下降,这是因为随着酶解时间的延长,苦丁茶细胞壁及细胞间层的纤维素阻挡层已被有效破解,活性物质大多已从细胞内扩散到溶液中,细胞内外的物质浓度已达到了一种动态平衡,酶解时间适宜时刚好能将细胞壁破坏有利于熊果酸的溶出,酶解时间增多,杂质也大量溶出而不利于熊果酸的纯化,故适宜的酶解时间应为1.0 h。

由图1C可知,在酶解温度46～48 ℃时,苦丁茶熊果酸的含量随着温度的升高而增加,48 ℃达到最大值,之后则变化不大。推测其原因可能是温度升高,可能会引起部分酶失活,丧失催化能力,温度进一步提高,则不利于酶活力的发挥,因而提取效果变差,此外温度升高,有可能破坏熊果酸的结构,故适宜的提取温度为48 ℃。

由图1D可知,苦丁茶熊果酸的含量随酶用量的增大而增大,但是增大的幅度比较小,这是因为当酶浓度达到一定值时,与底物结合达到动态平衡,再加大酶用量不利于节约成本。此外可能会引起酶促反应的产物在溶液中积累会对酶促反应造成抑制。故酶用量对苦丁茶熊果酸的含量影响较小,综合考虑成本情况,选取酶用量为0.5 g。

2.2 响应面法优化结果

2.2.1 回归模型及方差分析 根据响应面试验的设计方案,以酶解温度(A)、酶解pH(B)、酶解时间(C)为变量,以熊果酸含量(Y)为响应值,进行拟合得到多元二次回归拟合方程模型为:Y=37.49-0.15A-0.20B-0.33C+0.015AB+2.29AC+0.24BC-2.81A2-6.38B2-4.63C2,试验结果如表2所示。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface methodolody experiment

由表3可知,模型的F值为65.79,P值<0.0001,失拟项P=0.1005,说明模型具有显著性,与试验具有较好的拟合性,误差小。R2=0.9883,说明模型拟合度较好,用于优化酶解提取苦丁茶熊果酸的工艺是可行的。AC、A2、B2、C2的P值均小于0.01,说明酶解温度和酶解pH的一次项,酶解温度、酶解时间、酶解pH的二次项对熊果酸含量具有极显著影响(P<0.01)。通过比较P值和F值可得出各因素的影响大小为:酶解时间>酶解pH>酶解温度。

表3 响应曲面二次回归方程模型方差分析结果Table 3 Variance analysis of response surface equations of quadratic regression model

2.2.2 响应面分析 响应面曲面坡度的平缓与陡峭程度反映因素数值变化时对熊果酸含量的响应灵敏程度,响应面图形的坡度越陡,响应值敏感;等高线形状为椭圆形则表示两因素交互作用显著,圆形则表示两因素交互作用不显著。由图2～图4可知,酶解温度与酶解pH的交互作用影响不显著;酶解温度与酶解时间的交互作用影响显著;酶解时间与酶解pH的交互作用影响不显著。

图2 酶解温度与酶解pH对苦丁茶熊果酸含量的影响Fig.2 Effects of enzymolysis temperature and pH on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

图3 酶解温度与酶解时间对苦丁茶熊果酸含量的影响Fig.3 Effects of enzymolysis temperature and enzymolysis time on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

图4 酶解时间与酶解pH对苦丁茶熊果酸含量的影响Fig.4 Effects of enzymolysis time and enzymolysis pH on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

2.2.3 最佳优化工艺与验证试验 由Design-Expert V8.0.6软件分析得到最佳提取工艺为:酶解温度为47.91 ℃,酶解pH为4.99,酶解时间为0.98 h,苦丁茶熊果酸含量为(37.50±0.62) mg/g。考虑实际操作的可行性,将其优化为:酶解温度为48 ℃、酶解pH为5.0、酶解时间为1.0 h,以优化的工艺条件平行三次进行验证实验,求平均值。得到苦丁茶熊果酸含量为(37.28±0.89) mg/g,相对标准偏差为2.04%,重复性良好,与模型预测值(37.50±0.62) mg/g相近,表明响应面法酶解提取苦丁茶熊果酸的工艺条件可行性好,与实际情况拟合较好。

2.3 苦丁茶熊果酸的纯化精制

AB-8大孔吸附树脂分离纯化并采用乙醇重结晶得到的苦丁茶熊果酸,经高效液相色谱分析纯度,结果见图5。由图5B可知,经精制后的苦丁茶熊果酸杂质较少,保留时间为15.46 min,采用面积归一化法计算其纯度为93.1%。在16.52 min处为熊果酸的同分异构体齐墩果酸,但含量较少。

图5 熊果酸标准品(A)和供试品(B)的高效液相色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of UA standard(A)and sample(B)

2.4 苦丁茶熊果酸对CCl4致肝损伤小鼠的保护作用

2.4.1 苦丁茶熊果酸对CCl4致肝损伤小鼠血清ALT、AST水平及肝组织SOD、GSH-Px和MDA水平的影响 ALT和AST为检查肝功能的重要指标,当肝细胞肿胀破裂、受损或坏死时,肝细胞内的ALT和AST释放至血清,导致血清中ALT和AST水平升高;脂质过氧化反应的终产物为MDA,其可与细胞膜蛋白结合生成加醛复合物而破坏生物膜的结构和功能,MDA水平可以反映肝组织脂质过氧化反应的程度;当肝细胞遭到大量氯仿自由基攻击时,细胞内SOD和GSH-Px会起到清除自由基的作用,SOD和GSH-Px水平的高低反映机体清除自由基的能力,间接反映肝细胞受损的程度。由表4可知,与正常组相比,模型组小鼠血清ALT、AST活性以及肝组织中MDA含量显著升高(P<0.05);肝组织中SOD、GSH-Px水平显著降低(P<0.05),说明CCl4致小鼠肝损伤模型造模成功。与模型组相比,联苯双酯组、熊果酸各剂量组血清ALT和AST活性显著降低(P<0.05)。与模型组相比,联苯双酯组、熊果酸各剂量组肝组织SOD和GSH-Px水平显著提高,并显著降低MDA水平(P<0.05)。

表4 熊果酸对CCl4致肝损伤小鼠血清ALT、AST水平及肝组织SOD、GSH-Px和MDA水平的影响Table 4 Effects of UA on the level of ALT,AST in serum,SOD,MDA and GSH-Px in liver tissue of CCl4-liver-injury

2.4.2 苦丁茶熊果酸对CCl4致肝损伤小鼠肝组织病变的影响 从图6可以看出,正常组小鼠肝组织细胞排列整齐,结构完整,无炎症细胞浸润。模型组小鼠肝细胞排列紊乱,结构破损,伴有炎症细胞浸润,可见坏死斑点。联苯双酯组小鼠肝细胞排列较整齐,细胞大小较一致,结构较完整,部分细胞肿胀并有少许胞浆疏松和炎症细胞浸润,说明联苯双酯对损伤肝细胞具有较好的治疗作用。熊果酸低剂量组小鼠肝细胞排列有些紊乱,部分肿胀。熊果酸中、高剂量组小鼠肝细胞排列较整齐,细胞肿胀、炎症细胞浸润及坏死情况减少。病理学观察表明苦丁茶熊果酸能够减轻CCl4致肝损伤小鼠肝细胞受损程度。

图6 苦丁茶熊果酸对CCl4致肝损伤小鼠肝组织病变的影响(HE,100×)Fig.6 Effect of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng on liver pathology in induced by CCl4 liver-injuryed mice(HE,100×)

3 结论

试验采用响应面法优化酶解提取苦丁茶中熊果酸的工艺,得到最优条件为:酶解温度为48 ℃,酶解pH为5.0,酶解时间为1.0 h,该条件下熊果酸含量为(37.28±0.89) mg/g,与模型预测值(37.50±0.62) mg/g相近,与实际情况拟合较好。综合实验小鼠血清和肝脏中多项生化指标以及肝组织病理形态观察结果,苦丁茶熊果酸对CCl4致小鼠肝损伤具有明显保护作用,可为开发苦丁茶作为保肝功能性食品提供可靠的理论依据。本文阐明了熊果酸是苦丁茶保肝作用的活性成分之一,但作用机制有待进一步研究,这也是本课题组下一步研究的重点。