赤霞珠葡萄梗黄酮、原花青素和多酚的提取工艺优化

李彩霞,焦 扬,崔 玮,古小梅,张永博

(1.河西学院农业与生物技术学院,甘肃张掖 734000; 2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室,甘肃张掖 734000)

葡萄梗是葡萄深加工的主要废弃物,资源丰富,并含有丰富的膳食纤维、蛋白质和单宁[1-3]、黄酮、原花青素、白黎芦醇等活性成分[4-5],这些成分具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗肿瘤、消炎、预防心脑血管疾病、防治冠心病及中风等多种药理功能[5-8]。目前,葡萄及其副产品的研究主要集中在果皮、籽活性成分的提取与分析,而对于葡萄梗的研究相对滞后,李浡等[5]对葡萄梗中的多酚物质进行了提取和分析,发现绿原酸含量较高;陈国刚等[9]对葡萄梗中单宁的提取工艺进行了优化,其提取率为9.37%;康彦芳等[10]以葡萄酒厂酿酒后废弃物葡萄梗为原料,采用超声波辅助法对葡萄梗中的白藜芦醇进行了提取。以上研究主要针对葡萄梗废弃物中单一组分的提取或报道,而对于黄酮、原花青素和多酚系统提取的研究尚未见报道。对葡萄梗黄酮、原花青素和多酚进行系统提取,能够在一定程度上减少葡萄梗资源的浪费,提高葡萄梗的附加值及提取效率,避免单一指标提取的繁琐性,具有重要意义。

乙醇-硫酸铵双水相体系与其他高聚物的双水相萃取相比,具有低廉、低毒、分相清晰,萃取相粘度小,有机溶剂用量少等特点[11],该技术广泛应用在生物工程、食品、制药等领域。

本文以张掖板桥庄园赤霞珠葡萄梗为原料,以葡萄梗中黄酮、原花青素和多酚含量的综合评分为评价指标,采用正交试验优化超声辅助双水相提取葡萄梗黄酮、原花青素和多酚的工艺,以期为葡萄梗的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤霞珠葡萄梗 甘肃省滨河食品有限公司(原料来源于张掖板桥庄园),样品挑去杂质,清洗干净,阴干,粉碎过60目保存备用;无水乙醇(相对密度0.7893)、甲醇 天津市光复科技有限公司 色谱纯;硫酸铵、浓盐酸、氢氧化钠 天津百世化工有限公司 分析纯;儿茶素 纯度≥99%，上海友思生物技术有限公司;芦丁、没食子酸、香草醛 纯度≥98%，国药集团化学制剂有限责任公司。

KQ-250B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;SHB-IIIA循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;DR6000紫外可见分光光度计 美国哈希;RE-2000A型旋转蒸发器 巩义市京华仪器有限责任公司;SHZ-2000型循环水式真空泵 河南省巩义市英峪予华仪器厂;BT125D电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同提取溶剂的选择 准确称取赤霞珠葡萄梗粉末1 g,按料液比1∶20 (g/mL)分别加入50%乙醇、95%乙醇、无水乙醇及乙醇-硫酸铵双水相体系,双水相的配制参照文献[12],在35 ℃超声(40 kHz、250 W)提取40 min,各提取液(双水相提取液置于分液漏斗中,分相,分出上相)定容至50 mL,分别测定各提取液的原花青素、黄酮和多酚含量。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 超声时间对葡萄梗原花青素、黄酮和多酚提取的影响 配制乙醇质量分数为24%、硫酸铵质量分数为20%的双水相40 mL 5份,分别加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超声提取20、30、40、50、60 min,抽滤,滤液于分液漏斗中静置分层,将上相定容至50 mL,测定上相中原花青素、黄酮和多酚的含量,考察超声时间对葡萄梗原花青素、黄酮和多酚提取的影响。

1.2.2.2 乙醇质量分数对原花青素、黄酮和多酚提取的影响 配制乙醇质量分数为20%、21%、22%、23%、24%、25%,硫酸铵质量分数为20%的双水相,按料液比1∶40 (g/mL)分别加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超声提取50 min,之后按1.2.2.1方法操作,考察乙醇对葡萄梗原花青素、黄酮和多酚提取的影响。

1.2.2.3 硫酸铵质量分数对葡萄梗原花青素、黄酮和多酚提取的影响 配制硫酸铵质量分数为18%、19%、20%、21%、22%,乙醇质量分数为24%的双水相,按料液比1∶40 (g/mL)分别加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超声提取50 min,之后按1.2.2.1方法操作,考察硫酸铵对葡萄梗原花青素、黄酮和多酚提取的影响。

1.2.2.4 料液比对葡萄梗原花青素、黄酮和多酚提取的影响 固定超声时间50 min、乙醇质量分数24%,硫酸铵质量分数20%,配制1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g/mL)的双水相,分别加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超声提取50 min,之后按1.2.2.1方法操作,考察料液比对葡萄梗原花青素、黄酮和多酚提取的影响。

1.2.3 正交试验优化提取工艺 在单因素实验的基础上,根据正交试验设计原理,以原花青素、黄酮和多酚的含量及其综合评分为考察指标,对超声时间、乙醇质量分数、硫酸铵质量分数和料液比设计4因素3水平方案[13],因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal experiment

1.2.4 原花青素含量的测定 原花青素含量测定参照文献[14]的香草醛盐酸比色法,以儿茶素为基准物,得到儿茶素标准溶液吸光度与儿茶素质量(mg)的线性回归方程y=4.985x+0.0215,R2=0.9993,根据回归方程计算原花青素的质量,原花青素的含量按下式计算。

式中:c为标准曲线中查的原花青素的质量(mg);vt为提取液总体积(mL);n为稀释倍数;w为样品重量(g);vs为测定液体积(mL)。

1.2.5 黄酮含量的测定 黄酮含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[15],以芦丁作为标准物,得到芦丁标准溶液的吸光度与芦丁质量(mg)的线性回归方程为y=1.1721x-0.0033,R2=0.9995。并根据回归方程计算黄酮的质量,按下式计算黄酮含量。

式中:c为标准曲线中查得黄酮的质量(mg);vt为提取液总体积(mL);n为稀释倍数;w为样品重量(g);vs为测定液体积(mL)。

1.2.6 多酚含量的测定 多酚含量的测定参照GB/T 8313-2018[16]的方法,以没食子酸作为标准品,采用福林酚试剂法绘制标准曲线,得回归方程为y=0.0139x+0.005,线性范围为0～50 μg,R2=0.9997。根据回归方程计算样品中多酚质量,按下式计算多酚的含量。

式中:c为标准曲线中查得多酚的质量(μg);vt为提取液总体积(mL);n为稀释倍数(g);w为样品重量;vs为测定液体积(mL)。

1.2.7 综合评价方法 以多酚、黄酮和原花青素3个指标的含量为评价指标进行综合评价,综合评价根据卫阳非等[17]介绍的方法:将各指标首先均标准化为0～1之间的“归一值”,对取值越大越好的指标,采用计算公式:di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin);再将各指标的“归一值”求几何平均数得总评OD 值,公式为OD=(d1d2…dk)1/k(k为指标个数)。

1.3 数据处理

数据处理用Excel 2003软件,利用DPS 12.5软件进行方差分析、Turkey多重比较(P<0.01为差异极显著),采用Origin 7.5软件作图,图中数据均为三次重复的平均值加标准差。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂对葡萄梗黄酮、原花青素和多酚提取效果的影响

由图1可知,4种提取溶剂中50%乙醇提取的黄酮含量最高,为69.36 mg/g,与双水相提取(66.85 mg/g)相比差异不显著(P>0.05),但极显著高于其它两种溶剂(P<0.01);原花青素和多酚的含量以双水相作为提取溶剂提取效果最好,显著高于(P<0.05)50%乙醇、95%乙醇和无水乙醇的提取效果。虽然50%乙醇提取的黄酮含量高于双水相提取,但原花青素和多酚的含量均低于双水相提取,从提取效果来看,双水相提取效果最好,无水乙醇提取效果最差,这种差异可能和提取物质的分子结构、溶液极性等因素有关[18]。为了得到更高的黄酮、原花青素和多酚的含量,后续重点考察超声辅助乙醇-硫酸铵双水相提取葡萄梗中黄酮、原花青素和多酚的工艺参数。

图1 不同提取溶剂对葡萄梗原花青素、黄酮、多酚含量的影响Fig.1 Effects of different extractants on PC, flavonoids and polyphenols contents注:不同大写字母表示同一指标各组间差异 极显著(P<0.01);图2～图5同。

2.2 单因素实验

2.2.1 超声时间对原花青素、黄酮和多酚提取的影响 由图2可知,随着超声时间的延长,原花青素、黄酮和多酚的含量整体趋势均在上升,在超声时间50 min时达到最高值,分别为87.33、122.72、72.05 mg/g,而后均下降,原花青素和多酚下降趋势较大。这是由于超声波引起的“空化效应”,有助于酚类物质的渗透,使原花青素、黄酮和多酚的含量增高,但是进一步延长超声时间,会使溶液温度升高,酚类成分发生氧化、降解,含量有所下降[19]。因此超声时间在50 min比较合适。

图2 超声时间对葡萄梗原花青素、黄酮、多酚含量的影响Fig.2 Effects of ultrasonic time on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.2.2 乙醇质量分数对原花青素、黄酮和多酚提取的影响 从图3可以看出,随着乙醇质量分数的增大,黄酮、多酚和原花青素的变化均呈现上升趋势,在乙醇质量分数为24%时均出现最大值,且与其它乙醇质量分数的提取效果差异极显著(P<0.01),继续增大浓度,原花青素、黄酮和多酚的含量呈下降趋势,其原因是乙醇质量分数增大,亲脂性成分溶出,而酚类物质的溶出降低[13],导致其黄酮、多酚和原花青素的含量降低,故乙醇质量分数以24%左右为宜。

图3 乙醇质量分数对葡萄梗原花青素、黄酮、多酚含量的影响Fig.3 Effects of mass fraction of ethanol on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.2.3 硫酸铵质量分数对原花青素、黄酮和多酚提取的影响 由图4可知,(NH4)2SO4质量分数在18%～20%之间时,原花青素、黄酮和多酚的含量逐渐增大并达到最大值,分别为87.37、122.93、72.48 mg/g,极显著(P<0.01)高于(NH4)2SO4其它质量分数的提取效果,当大于20%时,原花青素、黄酮和多酚的含量逐渐降低。其原因是随着(NH4)2SO4用量的增加,(NH4)2SO4对水的束缚能力增强,乙醇从(NH4)2SO4水相中游离出来,而水分子也离开乙醇相,导致上相的乙醇体积增加,而下相相对降低,最终改变了上相的极性,从而影响了酚类成分在其上下相的分配[20]。因此选择(NH4)2SO4用量为20%左右。

图4 硫酸铵质量分数对葡萄梗原花青素、黄酮、多酚含量的影响Fig.4 Effects of mass fraction of ammonium sulfate on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.2.4 料液比对原花青素、黄酮和多酚提取的影响 由图5可知,随着料液比的增大,原花青素、黄酮、多酚的含量也随着增大,在料液比1∶40 (g/mL)时,原花青素、黄酮和多酚的含量达到最大,且与其它料液比的提取效果相比较差异极显著(P<0.01)。当料液比高于1∶40 (g/mL)时各指标均下降。这是因为在超声提取过程中,溶剂的用量越多,其相应的传质动力就越大,扩散到溶剂里的酚类化合物就越多[19]。但是,在产生相同热量的条件下,由于液料比的增大,使提取液温度下降,固相和液相之间的平衡降低,导致提取效果的降低。从提取效果来看,选择料液比为1∶40 (g/mL)左右为宜。

图5 料液比对葡萄梗原花青素、黄酮、多酚含量的影响Fig.5 Effects of material liquid ratio on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.3 正交试验及结果

在单因素实验的基础上,以超声时间、硫酸铵质量分数、乙醇质量分数和料液比为自变量,分别以多酚、黄酮和原花青素的含量为因变量,建立9个处理组,正交设计方案所得的试验结果见表2。以多酚、黄酮和原花青素3个指标的含量为评价指标进行综合评分,综合评分的极差和方差分析见表3,从表3极差可知各因素对综合评分的影响的主次为D(料液比)>B(硫酸铵质量分数)>A(超声时间)>C(乙醇质量分数),由表2可知,在4个影响因素中,乙醇质量分数的极差最小,将其作为误差项做方差分析,方差分析见表3。从表3方差分析可以看出,各因素影响均不显著(P>0.05),从F值来看,F值越大,对各指标的影响就越大,料液比的F值最大,说明料液比对原花青素、黄酮和多酚提取影响最大,和极差分析结果一致。结合表2可知,超声辅助双水相综合提取葡萄梗原花青素、黄酮和多酚的最优组合为A2B2C2D2,即超声时间50 min、硫酸铵质量分数20%、乙醇质量分数为24%、料液比为1∶40 (g/mL)。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 正交设计方差分析表(完全随机模型)Table 3 Variance analysis of orthogonal design(complete random model)

2.4 验证试验

对综合优化的工艺进行5组重复放大试验(料液比放大8倍),赤霞珠葡萄梗多酚、黄酮、原花青素的含量分别为72.85、122.21、87.67 mg/g,此时的最大评分为1.001,与表2中序号2的综合评分接近,表明采用正交设计,综合评分法优化超声辅助乙醇-硫酸铵双水相提取赤霞珠葡萄梗中多酚、黄酮和原花青素的工艺具有可行性。

3 结论

本研究比较了几种提取溶剂对赤霞珠葡萄梗黄酮、原花青素和多酚提取的效果,结果表明,利用双水相法萃取葡萄梗中黄酮、原花青素和多酚,各指标均富集在上相有机溶剂中,目标成分明显高于无水乙醇、95%乙醇、50%乙醇的提取,且水溶性成分富集在下相,目标物质易于分离和回收,同时所用试剂乙醇低毒,适宜工业化大规模生产。通过单因素实验及正交试验设计,采用多指标综合评分法优化得到超声辅助双水相提取赤霞珠葡萄梗中黄酮、原花青素和多酚的工艺为:超声提取时间50 min、乙醇质量分数24%、硫酸铵质量分数20%、料液比(1∶40) g/mL。此条件下,赤霞珠葡萄梗中多酚、黄酮、原花青素的含量分别为72.85、122.21、87.67 mg/g。本研究在优选提取工艺时,选用多酚、黄酮及原花青素3个指标为评价指标,利用多指标归一化对数据进行处理,该工艺避免了采用单一指标提取的局限性,同时减少重复提取指标的繁琐性,降低成本,使评价指标更加科学合理。