超高效液相色谱串联质谱法测定全蛋粉中的双酚A和双酚S

张 昊,凌映茹,吉文亮,刘华良,朱 峰

(江苏省疾病预防控制中心,江苏南京 210009)

双酚A(bisphenol A,BPA)是一类典型的环境激素,在聚碳酸酯塑料行业以及环氧树脂行业中应用广泛,BPA可以与多种生理受体(如雌激素受体α/β、雌激素相关受体γ等)相互作用干扰生物体体内激素水平,损害女性子宫、卵巢功能，降低男性精子质量、影响婴幼儿和青春期前期儿童的神经发育、诱发青春期性早熟、引发肥胖等[1-2]。2011年我国卫生部等六部门禁止BPA用于婴幼儿奶瓶的生产。双酚S(bisphenol S,BPS)作为BPA的替代物,具有类似于BPA的结构和更强的酸性、稳定性。虽然有毒理学研究表明,低剂量BPS可以影响鱼类[3]和啮齿类动物[4]的内分泌系统、影响雌激素分泌、降低繁殖能力、导致肥胖等[2,5],但缺少足够的生理学毒理学证据,目前世界上并没有相关的使用禁令。由于BPA和BPS在食品包装材料等行业的广泛应用,在多种食品样品中存在BPA和BPS检出,尤其是在猪肉、鸡蛋、海鲜、水果等食品样品中[6]。

鸡蛋粉是指鲜蛋经过打蛋、分离、过滤、均质、巴氏杀菌、喷雾干燥而制成的干蛋产品,是蛋类制品的一种。鸡蛋粉主要有全蛋粉、蛋黄粉、蛋白粉三种,其中全蛋粉由于其营养价值与鲜鸡蛋接近,在使用、运输、储存方面比鲜鸡蛋更为便捷,因此被广泛使用于蛋糕、饼干、调味料、油炸食品等挂糊产品的生产过程中。由于全蛋粉的原料——鸡蛋中可能存在BPA和BPS,同时在全蛋粉的生产、包装过程可能存在的污染,均会使BPA和BPS在全蛋粉中进一步积累,使得这两类物质进入以全蛋粉为原材料的下游相关食品中,造成人体对BPA和BPS的暴露。而目前并没有关于全蛋粉中双酚类化合物的测定方法,因此建立相应的检测方法十分有必要。

目前BPA及其类似物的检测方法主要有液相色谱法[7-9]、气相色谱-质谱法[10-11]和液相色谱-质谱法[12-16],其中液相色谱串联质谱法由于其较高的分离效率和灵敏度而被广泛应用。目前对于食品中BPA和BPS的前处理方式主要集中在固相萃取法(solid phase extraction,SPE)[11-16]。王胜利等使用QuEChERS-SPE法对于婴儿配方奶粉进行净化,能够有效去除奶粉中基质对多种双酚化合物的干扰[13];张媛媛等使用HLB小柱完成瓶装水中BPA和BPS的净化富集,BPA和BPS的平均回收率均高于95%[14];张艳等使用了GCB小柱完成了对罗非鱼、猪肉罐头等食品基质的净化,其中BPA和BPS的平均回收率均高于85%[15];曹杰等同样使用GCB小柱完成了谷物类样品基质的净化,其中BPA和BPS的平均回收率均高于90%[16]。然而,这些工作并未涉及脂质含量高(脂质含量>30%)的样品。与猪肉、鸡蛋等食品相比,全蛋粉中脂肪含量≥42%[17],基质中脂肪含量高,对于前处理过程中去除基质、降低基质干扰的要求更高,需要建立更为有效、便捷的前处理方法才能保证这类样品中双酚类物质测定的准确性和稳定性。

分散系固相萃取-增强性脂质基质去除(dispersive solid-phase extractions enhanced matrix removal lipid,dSPE-EMR-Lipid)是一种新型脂质净化手段,该方法利用填料表面修饰基团的空间结构与脂质结构中长碳链存在尺寸排阻作用以及填料与脂质结构中长碳链的吸附作用,对于长链脂质有极强的吸附去除效果[18-20]。本文使用dSPE-EMR-Lipid去除样品中的脂质后,使用PRiME HLB小柱进一步净化,建立快速、便捷地测定全蛋粉中的BPA和BPS的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全蛋粉 购买于超市和网店,总共20份(总共15种不同品牌,其中5种品牌为两种不同批次);BPA(CAS:80-05-7)、BPS(CAS:80-09-1) 纯度>99%,上海TCI公司;BPS-13C12纯度>98.0%,加拿大TRC公司;BPA-D4纯度>98.0%,美国C/D/N Isotopes公司;Acquity UPLC BEH C18液相色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 美国Waters公司;乙腈、甲醇、甲酸、丙酮 色谱纯,德国Merk公司;实验用纯水 实验室自制一级水;纯水 色谱级，美国Fisher公司;瓶装纯净水 浙江娃哈哈公司。

SuperClean GCB/NH2双层固相萃取柱(GCB 500 mg+NH2500 mg/6 mL)、SuperClean GCB固相萃取柱(500 mg/6 mL) 美国Supelco公司;Waters PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL) 美国Waters公司;Bond Elut LRC NH2固相萃取柱(100 mg/10 mL)、Bond Elut EMR-Lipid 美国Agilent公司;LC-30A超高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司;AB Sciex QTRAP 5500质谱仪 美国AB Sceix公司;台式离心机 德国Sigma公司;氮吹仪 美国Organomation公司;Vortex-6涡旋混合器 江苏其林贝尔公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品及同位素内标溶液配制

1.2.1.1 标准品溶液配制 分别准确称取BPA、BPS标准品 10 mg(精确至0.1 mg)至10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,配制成1000 mg/L的单一标准储备液。准确移取适量的BPA、BPS单一标准储备液至10 mL容量瓶中,使用甲醇-水(v∶v=1∶4)稀释配制成质量浓度BPA 1.0 mg/L,BPS 0.4 mg/L混合标准使用液。

1.2.1.2 同位素内标溶液配制 分别准确称取同位素内标BPA-D4、BPS-13C1210 mg(精确至0.1 mg)至10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,配制成1000 mg/L的单一同位素内标储备液。准确移取适量的BPA-D4、BPS-13C12同位素内标储备液至10 mL容量瓶中,使用甲醇-水(v∶v=1∶4)稀释配制成质量浓度为BPA-D40.5 mg/L,BPS-13C120.1 mg/L的混合内标使用液。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 样品提取 称取混匀后的样品1.0 g置于15 mL离心管中,加入3 mL水,涡旋混匀,加入50 μL混合内标使用液和5 mL乙腈,涡旋混匀后超声提取30 min,9000 r/min离心10 min,上清液全部转移至装有1 g已活化的dSPE-Lipid-EMR的50 mL离心管中(EMR-Lipid 使用前加入5 mL水进行活化),涡旋1 min,12000 r/min离心5 min,所得上清液用纯水稀释至25 mL,加入50 μL甲酸,充分摇匀后,12000 r/min离心5 min,将上清液转移至另一个干净的50 mL离心管,待净化。

1.2.2.2 净化 将所得上清液使用PRiME HLB柱(使用前依次用18 mL甲醇和6 mL水活化)上样,弃去滤液,分别使用6 mL水、6 mL甲醇-水溶液(v∶v=1∶1)淋洗,待淋洗液完全通过柱床后用洗耳球吹干柱床中的液体,用6 mL甲醇-丙酮(v∶v=4∶1)洗脱,洗脱液用氮气吹至近干。用1 mL甲醇-水(v∶v=1∶4)溶解残渣,待LC-MS/MS测定。

空白实验:使用纯水代替样品,使用与样品相同的前处理得到实验的过程空白值。

1.2.3 实验用水的选择 本实验考察了Fisher牌色谱级纯水、娃哈哈牌纯净水和实验室自制一级纯水中BPA和BPS的本底值。使用4 mL上述三种纯水分别按1.2.2中空白实验进行富集,上机测定。选择本底值低、成本低、易获得的纯水作为实验用水。

1.2.4 样品除脂净化手段的选择 考察了不同净化手段对基质的净化效果和对加标模拟样品的回收效果。使用加标水平为BPA 5 μg/kg、BPS 2 μg/kg的全蛋粉模拟样品,比较不同除脂方式与GCB小柱协同处理(正己烷萃取后使用GCB小柱净化、冷冻(-20 ℃,2 h),除脂后使用GCB小柱净化、使用GCB/NH2双层SPE小柱净化、先使用GCB小柱净化后洗脱液使用LRC NH2小柱净化)和EMR-Lipid与不同SPE小柱协同处理(EMR-Lipid除脂后使用GCB小柱净化、EMR-Lipid除脂后使用PRiME HLB小柱净化、EMR-Lipid除脂后使用PPL小柱净化)对于模拟样品提取液的处理效果,根据不同手段的回收率高低和前处理过程需要的时间长短选择合适的样品前处理手段。

1.2.5 色谱条件 色谱柱 Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温:35 ℃;样品室温度:4 ℃;流速:0.3 mL/min;流动相 A:甲醇;流动相B:水,具体流动相洗脱程序见表1;进样量:5 μL。本文考察了甲醇-0.1%甲酸水;甲醇-水;甲醇-0.1%氨水;乙腈-水;甲醇/乙腈(v∶v=4∶1)-水;甲醇/乙腈(v∶v=2∶1)-水;甲醇/乙腈(v∶v=1∶1)-水;甲醇/乙腈(v∶v=1∶2)-水;甲醇/乙腈(v∶v=1∶4)-水作为流动相时对各种物质峰型和分离度的影响。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program for mobile phase

1.2.6 质谱条件 离子源:ESI(-);喷雾电压4.5 kV;源温550 ℃;气帘气压:40 psi;雾化气压:65 psi;干燥气压:65 psi;多反应监测扫描模式(MRM)进行采集,目标离子质谱参数见表2。

表2 BPA和BPS及相应同位素内标的质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters for the BPA,BPS and corresponding isotope internal standards

1.2.7 线性方程、检出限及定量限 实验使用混合标准使用液和混合内标使用液配制相应的标准曲线系列:BPA 1、2、5、10、20、50 μg/L,BPS 0.4、0.8、2、4、8、20 μg/L,同位素内标浓度:BPA-D425.0 μg/L,BPS-13C125 μg/L,使用1.2.5及1.2.6中色谱条件与质谱条件进行测定,以标准品峰面积和内标峰面积Ai/Ais为纵坐标,标准品浓度Ci为横坐标做标准曲线。根据3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)确定仪器的检出限和定量限。

1.2.8 回收率实验 对低本底值的全蛋粉添加三个浓度水平:5、20、40 μg/kg(BPA),2、8、16 μg/kg(BPS),使用优化后的前处理手段平行测定六次,计算日内相对标准偏差,连续三天,每天平行测定6次,计算其日间相对标准偏差。

1.2.9 实际样品检测 本实验对20份从超市和网店购买的全蛋粉进行检测,验证方法的可靠性和适应性。

1.3 数据处理

使用Analyst和MultiQuantTM软件(美国AB SCIEX公司)采集数据并积分,使用Origin 9.0(美国Origin Lab公司)作图,使用Microsoft Excel 2010(美国微软公司)进行数据统计分析。

2 结果与讨论

2.1 实验用水的选择

BPA和BPS在环境中分布广泛,可通过生产途径进入相关实验耗材中,如果实验中使用的水的BPA和BPS本底值过高,会对测定结果造成影响。通过空白实验比较了Fisher牌色谱级纯水、实验室自制一级水和娃哈哈牌瓶装纯净水中BPA和BPS的含量。结果显示,Fisher牌色谱级纯水、实验室自制一级水以及娃哈哈牌瓶装纯净水的BPA含量分别为0.37、0.45、2.30 μg/L,BPS含量为0.07、0.08、0.11 μg/L。三种水样在BPS的含量十分接近,但娃哈哈牌纯净水BPA含量相对较高,不适合在本实验中使用,实验室自制一级水与Fisher牌色谱级纯水在BPA和BPS的含量上接近,考虑到成本问题,因此选择实验室自制一级水作为实验用水。

2.2 样品除脂净化手段的选择

参考文献[15-16]中单纯使用GCB小柱对模拟鸡蛋粉样品净化后出现以下问题:a、复溶后样品溶液浑浊,使用高速离心后无改善;b、使用该样品溶液连续进样后,出现前后针进样BPA信号响应明显不同的现象;c、连续多针进样后BPA和BPS的保留时间发生漂移,且信号响应减弱。这说明单独使用GCB小柱无法有效净化鸡蛋粉中的基质,因此本文考察了不同的脂质去除手段和不同填料类型SPE小柱协同净化对鸡蛋粉中基质的净化效果。

使用不同的除脂手段与不同类型SPE小柱协同净化的具体结果见表3。结果显示,正己烷萃取后使用GCB小柱净化、GCB/NH2双层小柱净化、EMR-Lipid除脂后使用PPL小柱净化在BPA的回收率上高于80%,但BPS的回收率低于70%,冷冻除脂后使用GCB小柱净化在两个化物的回收率均低于70%,GCB小柱与LRC NH2小柱协同净化和EMR-Lipid与GCB小柱协同净化、EMR-Lipid与PRiME HLB小柱协同净化在两个化物的回收率上均高于80%,但是EMR-Lipid与GCB小柱协同净化后BPA的基质抑制仍然比较严重,同位素内标BPA-D4的信号抑制达到50%以上,增加EMR粉末使用量也无法改善,这说明造成抑制的并非基质中的脂质。推断出现该情况的原因可能是GCB小柱填料为片状结构的石墨化炭黑,带有芳香性的正六元环结构,且呈正电性,具备反相和离子交换双重保留机制,既能保留非极性化合物,也能保留强极性化合物[21]。正由于这种强吸附能力,导致被吸附在固相萃取小柱上的一部分基质无法通过选择性淋洗去除,最后随洗脱液洗脱下来。PRiME HLB柱由于其填料的选择性保留可对多种基质通过选择性淋洗有效去除,从而降低基质抑制。使用GCB小柱与LRC NH2小柱协同净化操作复杂(LRC NH2需要将GCB小柱净化后的洗脱液,通过活化后的LRC NH2小柱才能完成除脂操作),整个净化过程需要40～50 min,而EMR-Lipid与PRiME HLB小柱协同净化操作简单(EMR-Lipid只需要两次离心便能完成除脂操作,并且该除脂操作在PRiME HLB 小柱净化操作前),整个净化过程耗时为25～30 min。考虑到EMR-Lipid除脂消耗时间更短,因此将EMR-Lipid与PRiME HLB协同净化作为本方法的前处理方式。

表3 不同除脂方法的回收率结果Table 3 Recoveries of the different removal methods of lipid

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 流动相的选择 双酚类化合物自身结构中具有酚羟基,流动相的酸碱度对于双酚类物质的电离效果有不同的影响。首先考察了以甲醇作为有机相时,不同酸度水相(0.1%甲酸水、水、0.1%氨水)对于BPA和BPS的峰型及分离情况,以纯水为水相时BPA和BPS的信号强度作为参考标准。使用0.1%甲酸溶液时,两个化合物信号基本消失,可能是因为是质子会抑制两个化合物在离子源中的电离;使用0.1%氨水溶液时,BPA的信号增强了50%,然而BPS的信号响应降为原先的50%,但考虑到BPS属于样品中含量较低的目标物,需要更高的灵敏度,0.1%氨水不适合作为水相。因此只能选择纯水作为水相。

随后考察了以纯水作为水相,比较甲醇、乙腈以及甲醇/乙腈混合溶剂(v∶v=4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4)对BPA和BPS响应信号的影响。以甲醇为有机相时,BPA和BPS的信号强度作为参考标准。使用乙腈时,BPA的信号响应明显增强,但是在目标信号峰附近存在干扰峰;使用甲醇/乙腈的混合溶剂(v∶v=4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4)对两个化合物的信号响应并没有提高,因此选用纯水和甲醇作为方法流动相。

2.3.2 色谱柱的选择 考察了BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)对于BPA和BPS的色谱分离情况。两类色谱柱均能给出对称性良好的峰型,但BEH C18柱作为分析柱时峰型更为尖锐,因此选择BEH C18柱作为分析柱。该色谱条件优化结果与文献报道的结果相符[15-16],标准品中BPA、BPS及其同位素内标的提取离子流图见图1。

图1 BPA和BPS及相应同位素内标的提取离子流图Fig.1 Extracted ion chromatogram of BPA,BPS and corresponding isotope internal standards注:A:BPA 20 μg/L;B:BPA-D4 25 μg/L;C:BPS 8 μg/L;D:BPS-13C12 5 μg/L。

2.4 线性范围、检出限及定量限

如表4所示,BPA和BPS在各自质量浓度范围内线性良好。根据3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)确定仪器的检出限和定量限,可以得到BPA的检出限为0.3 μg/kg,定量限为1.0 μg/kg,BPS的检出限为0.1 μg/kg,定量限为0.3 μg/kg。

表4 两种化合物的线性方程,线性范围,相关系数,检出限,定量限Table 4 Linear equitation,linear range,correlation coefficient,LOD and LOQ of two compounds

2.5 加标回收率和精密度

表5的结果显示,BPA在三个加标水平的回收率为98.8%～105%,RSD日内为3.84%～8.58%,RSD日间为5.65%～8.74%;在三个加标水平BPS的回收率为98.5%～102.5%,RSD日内为3.01%～7.86%,RSD日间为3.18%～7.03%。BPA和BPS的回收率均高于95%,日内相对标准偏差和日间相对标准偏差均小于10%,说明本方法具有较高的回收率、精密度和稳定性。

表5 不同加标水平的回收率及日内相对标准偏差(n=6)和日间相对标准偏差(n=3)Table 5 Recovery,intra-day relative standard deviation(n=6) and inter-day relative standard deviation(n=3)for different spiked level

2.6 样品测定结果

使用优化好的样品前处理方法和仪器条件对20份购于商店或网店的全蛋粉进行检测,结果显示BPA和BPS在20份样品中均有检出,其中BPA含量为2.4～3.8 μg/kg;BPS含量为0.45～0.82 μg/kg。但检出值均未超过GB9685-2016《食品接触材料及制品添加剂使用标准》[22]中规定的特定迁移限量(SML)(BPA的SML为0.6 mg/kg,BPS为0.05 mg/kg)。

3 结论

本文针对全蛋粉中脂质含量较高(脂质含量>30%)的特点,使用dSPE EMR-Lipid这种对于直链脂质有特异性去除的材料有效降低了因脂质造成的基质抑制,结合PRiME HLB小柱对于其他基质的选择性去除进一步降低了基质对于BPA和BPS测定的干扰。方法具有良好的线性(相关系数均大于0.999),目标化合物的平均回收率均大于98%,日间相对标准偏差和日内相对标准偏差均小于10%,前处理操作简便,可以用于鸡蛋粉中BPA和BPS的食品安全风险监测工作。