模拟胃肠道消化过程中迷迭香提取物总酚及抗氧化活性变化

刘胜男,余敏敏,潘菁菁,申瑞玲,李 红,相启森

(郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南郑州 450001)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)是一种原产于地中海沿岸和非洲北部的天然植物香辛料[1]。迷迭香富含萜类、酚类、黄酮类等多种活性物质[2-5],其中鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等多酚类物质是迷迭香的主要活性成分[6-7]。国内外研究表明,迷迭香所富含的多酚类物质具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗肿瘤、延缓衰老等多种生理活性功能[8-10]。研究表明,胃肠道消化过程可能对多酚类物质的结构、含量及其抗氧化、抗炎等生理活性造成影响。Kahle等[11]研究发现,表儿茶素在肠液中会异构化生成儿茶素;Ryu等[12]发现覆盆子提取物中的花青素在体外胃消化过程中较稳定,而在肠消化时其含量降低了55%;陈希苗等[13]发现,山楂多酚在胃消化过程中稳定性较好,但在肠消化过程中易降解,含量显著降低。因此,研究植物提取物在消化过程中的含量及活性变化对于揭示其活性功能具有重要意义。然而,目前关于迷迭香提取物在消化过程中的含量和活性变化规律方面的研究相对较少。

因此,本实验通过研究迷迭香提取物多酚类物质在模拟胃肠道消化过程中的动态含量变化,并测定该提取物在模拟消化过程中的DPPH·清除能力、铁还原能力(Ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)以及超氧阴离子自由基清除能力,分析抗氧化活性与总酚含量的相关性,以期为迷迭香在食品抗氧化、营养保健等方面的应用提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

迷迭香 亳州市雅丽百花茶有限公司;胃蛋白酶(P7000-100G,≥250 U/mg)、胰酶(P1750-100G,≥100 U/mg)、胆汁盐和二甲基亚砜(DMSO) 美国Sigma公司;Folin-Ciocalteu试剂、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox) 上海源叶生物科技有限公司;超氧阴离子自由基测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、没食子酸 上海阿拉丁试剂有限公司。

Multiskan GO型全波长酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;C012型多功能料理机 九阳股份有限公司;HH-S6型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;HH-8J型数显恒温水浴锅 常州润华电器有限公司;XD-52AA型旋转蒸发仪 上海贤德实验仪器有限公司;BSA224S-CW型电子天平 德国Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 迷迭香提取物的制备 将迷迭香粉碎后,过40目筛,备用。准确称取100.00 g迷迭香粉末,加入400 mL 80%(V/V)乙醇溶液,混匀后于室温静置提取2 h,过滤得上清液,连续提取2次,合并滤液,于40 ℃水浴下旋转蒸发,所得浓缩液真空冷冻干燥24 h,得到迷迭香提取物,研磨,过100目筛后置于-18 ℃冰箱备用。

1.2.2 体外模拟消化 模拟胃肠消化过程参考Minekus等[14]的方法,略作修改。模拟胃液和肠液电解质储备液的配方见表1。

表1 模拟胃液和肠液电解质储备液Table 1 Preparation of electrolyte stock solutions for simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid

分别取200 mL迷迭香提取物水溶液(1.0 mg/mL)、150 mL模拟胃液电解质储备液、32 mL胃蛋白酶储备液(25000 U/mL)和100 μL CaCl2溶液(0.3 mol/L),充分混匀,用1 mol/L HCl溶液调节pH至3.0,最后用去离子水补充体积至400 mL。将上述样品于37 ℃、100 r/min的恒温水浴条件下进行模拟胃消化反应,分别于0、30、60、90、120、150和180 min取样,备用[14]。

分别取模拟胃消化3 h后150 mL样品、82.5 mL模拟肠液电解质储备液、37.5 mL胰酶溶液(800 U/mL)、18.75 mL胆汁盐溶液(160 mmol/L)和300 μL CaCl2溶液(0.3 mol/L)并混匀,用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0,最后用去离子水补充至300 mL。将上述样品于37 ℃、100 r/min 的恒温水浴条件下进行模拟肠消化反应,分别于0、30、60、90和120 min取样,备用[14]。

1.2.3 总酚含量测定 取100 μL各个阶段消化样品,加入0.1 mL Folin-Ciocalteu试剂,混匀后避光反应6 min,依次加入1 mL 7%(V/V)Na2CO3溶液和0.8 mL去离子水并混合均匀,于室温避光反应50 min。测定其765 nm处吸光度,以没食子酸(0、25、50、100、200和300 μg/mL)为标样绘制标准曲线,得标准曲线方程A=0.0026C(R2=0.994),其中A是765 nm处吸光度,C是没食子酸的浓度,实验结果表示为1 g迷迭香提取物所含有的没食子酸当量(mg GAE/g DW)[13]。

1.2.4 模拟胃肠消化过程中迷迭香提取物的抗氧化活性测定

1.2.4.1 DPPH·清除能力的测定 取100 μL各个阶段消化样品,加入1.0 mL DPPH乙醇溶液(100 μmol/L),混匀后避光反应30 min,测定其517 nm处吸光度并计算清除率[15]。以Trolox梯度溶液(0、250、500、750、800 μmol/L)绘制标准曲线,得标准曲线方程A=0.1071C(R2=0.999),其中A是517 nm处吸光度,C是DPPH·的浓度。消化样品的DPPH·清除能力表示为1 g迷迭香提取物中所含Trolox当量(mg Trolox/g DW)。清除率计算公式如下:

DPPH·清除率(%)=(A2-A1)/A0×100

式(1)

式中,A1为试验组吸光度,A2为对照组(模拟消化液)吸光度,A0为空白组(DPPH·溶液)吸光度。

1.2.4.2 铁还原能力(FRAP)的测定 取4.0 mL FRAP工作液,加入100 μL各个阶段消化样品和0.9 mL去离子水,混匀后于37 ℃避光反应30 min,测定其593 nm处吸光度[16]。以FeSO4(0、25、50、100、150、200、300 μmol/L)为标准品绘制标准曲线,得标准曲线方程A=0.0027C(R2=0.999),其中A是593 nm处吸光度,C是FeSO4的浓度。实验结果表示为1 g迷迭香提取物中所含有的FeSO4当量(mmol FeSO4/g DW)。

1.2.4.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定 分别取50 μL模拟胃消化样品或肠消化样品,按照抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒操作说明书进行测定,结果表示为1 g迷迭香提取物所清除超氧阴离子自由基能力的活力单位(U/g DW)。

1.3 数据统计分析

所有试验均重复3次,采用SPSS for Windows 22.0软件进行数据处理,采用最小显著差异法(Least significant difference,LSD)进行显著性分析,P<0.05表示差异显著,采用Pearson correlation test进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 模拟胃肠消化过程中迷迭香提取物总酚含量的变化

模拟胃肠消化过程中迷迭香提取物总酚含量变化趋势如图1所示。在模拟胃消化阶段(图1A),迷迭香提取物消化产物中的总酚含量在30～90 min内显著升高(P<0.05),而在90～180 min其总酚含量趋于稳定(P>0.05),180 min时其总酚含量较0 min时提高了17.88%,这与芒果、芹菜汁等在胃消化过程中的多酚含量变化规律相一致[17-18]。迷迭香提取物在模拟胃消化过程中总酚含量呈现升高的趋势,可能是因为迷迭香提取物中存在结合态多酚,在酸性条件下被释放出来,从而导致总酚含量升高[18]。

如图1B所示,随着模拟肠消化时间的延长,迷迭香提取物消化产物中总酚含量呈现降低的变化趋势。与未经肠消化样品相比,120 min时模拟肠消化所得消化产物中总酚含量降低了19.64%(P<0.05)。上述实验结果与山楂、柑橘、蓝莓等在模拟肠消化过程中的多酚含量变化规律相一致[13,19-20]。陈希苗等[13]发现,山楂多酚和黄酮含量均随模拟肠消化时间的延长而显著降低。造成上述试验结果的原因可能是迷迭香所富含的鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等主要多酚化合物结构中均含有酚羟基,而酚羟基在较高pH环境中不稳定,易发生降解并生成其他物质[21]。

图1 模拟胃肠道消化过程中迷迭香提取物总酚含量变化Fig.1 Changes in total polyphenols contents of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion注:不同字母表示差异显著(P<0.05),图2～图4同。

2.2 模拟胃肠消化过程中迷迭香提取物抗氧化活性变化规律

2.2.1 模拟消化过程中迷迭香提取物清除DPPH·能力变化 由图2A可知,未进行模拟胃消化时,迷迭香提取物消化产物对DPPH·的清除能力为82.50 mg Trolox/g;经模拟胃消化180 min后所得样品中迷迭香提取物消化产物DPPH·清除能力较0 min时提高了20.36%(P<0.05),而迷迭香提取物DPPH·清除能力随模拟肠消化时间的延长而呈现下降趋势(图2B)。经模拟肠消化120 min后,迷迭香提取物消化产物的DPPH·清除能力较0 min时显著降低了74.08%(P<0.05)。模拟胃肠道消化过程中迷迭香提取物消化产物对DPPH·清除能力的变化规律与其总酚含量的变化规律相一致,这与Lingua等[22]研究结果相类似。

图2 迷迭香提取物模拟胃肠道消化样品对DPPH·清除能力变化Fig.2 Changes in DPPH· radical scavenging activity of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion

2.2.2 模拟消化过程中迷迭香提取物铁还原能力(FRAP)变化 如图3A所示,在模拟胃消化阶段,迷迭香提取物消化产物的铁还原能力随消化时间的延长而增强。消化180 min后,消化产物的FRAP由消化前的1.93 mmol FeSO4/g DW显著升高至2.17 mmol FeSO4/g DW,提高了11.76%(P<0.05)。如图3B所示,在模拟肠消化阶段,消化产物的FRAP则随着消化时间的延长而显著下降(P<0.05)。

未进行模拟肠消化前,迷迭香提取物消化产物的FRAP为2.49 mmol FeSO4/g DW,消化120 min后其FRAP显著降低了52.13%(P<0.05)。综合分析图1和图3试验结果,模拟胃肠道消化过程中迷迭香提取物消化产物的FRAP变化规律与其总酚含量变化趋势相一致。

图3 模拟胃肠道消化过程中迷迭香提取物铁还原能力变化Fig.3 Changes in FRAP values of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion

2.2.3 模拟消化过程中迷迭香提取物超氧阴离子自由基清除能力变化 如图4A所示,在模拟胃消化过程中,迷迭香提取物消化产物对超氧阴离子自由基的清除能力随消化时间的延长而增强,模拟消化180 min所得样品超氧阴离子自由基清除能力较未消化样品提高了22.07%(P<0.05)。如图4B,在模拟肠消化过程中,迷迭香提取物消化产物对超氧阴离子自由基的清除能力随消化时间的延长而显著降低(P<0.05)。模拟肠消化120 min时所得消化产物的超氧阴离子自由基清除能力较未消化样品降低了50.00%(P<0.05)。

图4 模拟胃肠道消化过程中迷迭香提取物超氧阴离子自由基清除能力变化Fig.4 Changes in scavenging activity of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion

2.3 消化样品中总酚含量与其抗氧化活性之间的相关性分析

由表2和表3可知,在模拟胃肠道消化过程中,迷迭香提取物消化产物的DPPH·清除能力、FRAP以及超氧阴离子自由基清除能力与其总酚含量之间呈良好的正相关性(P<0.01)。此外,迷迭香提取物DPPH·清除能力和FRAP之间也存在极显著的相关性(P<0.01),说明总酚含量能够较好地反映迷迭香提取物的DPPH·清除能力和FRAP。

表2 模拟胃消化过程中迷迭香提取物总酚含量与其抗氧化活性之间的相关性分析Table 2 Correlation analysis between total phenol contents of rosemary extract and its antioxidant activity potential during the simulated gastric digestion

表3 模拟肠消化过程中迷迭香提取物总酚含量与其抗氧化活性之间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between total phenol contents of rosemary extract and its antioxidant activity potential during the simulated intestinal digestion

3 结论与讨论

本实验结果表明,迷迭香提取物模拟胃肠道消化产物中总酚含量随模拟胃消化时间的延长而呈现升高的趋势,但随模拟肠消化时间的延长而呈现下降的趋势。这可能是由于模拟胃消化环境促进了迷迭香结合多酚的释放,从而使其含量升高;但具有较高pH的模拟肠消化环境可能导致迷迭香多酚类物质发生降解,从而造成总酚含量降低。此外,在模拟胃肠道消化过程中,迷迭香提取物消化产物对DPPH·、超氧阴离子自由基的清除能力及其FRAP与未消化前相比均显著升高(P<0.05);而经模拟肠消化120 min后,其消化产物对DPPH、超氧阴离子的清除能力及其FRAP均显著降低(P<0.05),其抗氧化活性变化趋势与总酚含量变化呈良好的正相关性。鼠尾草酸、迷迭香酸和鼠尾草酚等迷迭香主要多酚组分在消化过程中的结构、活性变化及其机制均有待于在今后的工作中进行深入研究。