葛仙米藻蓝蛋白和藻红蛋白的体外抗炎和抗紫外活性比较研究

余 佳,张瑞华,王 生,许文琦,王玉兰,*

(1.湖南炎帝生物工程有限公司,湖南省微藻生物工程技术研究中心,湖南株洲 412007; 2.中国医药工业研究总院,上海 200040; 3.上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室,上海 200437)

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)是一种黄颜色的染料,活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT,同时在细胞色素C的作用下,生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan),甲臜的多少可以用酶标仪在570 nm 处进行测定。在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比,因此可根据光密度OD570的值推测出活细胞的数目,从而判断其对细胞的影响。脂多糖LPS作用于细胞后,在LPS辅助蛋白和CD14的辅助下启动TLR4信号通路,激活下游的MAPK和NF-κB信号通路,促进炎症基因的转录分泌释放炎症因子NO和TNF-α[1]。炎症因子的过度释放是多种疾病的发生发展的重要原因,包括急性的脓毒血症、急性肺损伤以及慢性的动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、糖尿病和肥胖等[2]。目前临床上除了抗生素,尚缺乏有效的抗炎药物[3]。

葛仙米(NostocsphaeroidsKutzing),学名球状念珠藻,属蓝藻门[4](Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc)[5-9],是一种药食同源的经济蓝藻。葛仙米鲜品富含7%～8%的藻胆蛋白,主要为藻蓝蛋白和藻红蛋白,其中藻蓝蛋白是藻红蛋白的3.5倍左右[10];在野生葛仙米干品中,总蛋白含量高达50%以上,含有17种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸含量达44.6%[11]。野生葛仙米还富含藻多糖、矿物质和不饱和脂肪酸,是一种理想的健康食品[12]。在我国古代就有其历史记载,《药性考》中称葛仙米具有“清神解热,痰火能疗”的作用,《纲目拾遗》中则记载葛仙米能“解热,清膈,利肠胃”,《陕西中草药》称其在“清热收敛,益气明目,治烫火伤,夜盲症”有很好的功效[13]。野生葛仙米较为罕见,早年主要分布在湖北鹤峰、湖南张家界等少数地区的农田中,但由于农药的滥用,野生葛仙米大量减产,已濒临灭绝[14-15]。现在市场上主要为人工养殖的葛仙米,其干品蛋白质的含量不如野生葛仙米丰富,约在32%以上[16]。人工养殖的葛仙米于2018年被国家卫生健康委员会批复可作为新食品原料使用。

现代研究表明,葛仙米蛋白具有较好的调节免疫、抗炎、抗氧化、抗紫外损伤、抗肿瘤等功能[17]。在抗炎方面,Romay等[18]在12种炎症模型中发现藻蓝蛋白表现出剂量依赖的抗炎作用,可能会减少组胺释放、减轻髓过氧化物酶(MPO)活性及前列腺素E2的水平,而对于藻红蛋白的抗炎作用目前研究还很少。在抗紫外损伤方面,有研究显示,藻胆蛋白对小鼠NIH 3T3成纤维细胞具有显著的促增殖作用,并对UVA辐射损伤的小鼠NIH 3T3成纤维细胞具有修复作用[19],而对于藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗紫外损伤作用研究甚少。由人工养殖的葛仙米提取纯化得到的藻红蛋白和藻蓝蛋白的抗炎活性和抗紫外活性的比较研究更是鲜有报道。

本文通过考察藻蓝蛋白和藻红蛋白对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)细胞增殖及分泌NO和TNF-α的影响,研究了其抗炎的活性,并通过MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)方法考察藻蓝蛋白和藻红蛋白抗UVB辐照诱导NIH-3T3细胞紫外损伤,为人工养殖的葛仙米的精细深加工及药用开发提供一定的实验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛仙米藻红蛋白母液(纯度为95%)、葛仙米藻蓝蛋白母液(纯度为97%) 由湖南炎帝生物工程有限公司提供的葛仙米经反复冻融法提取出藻胆蛋白,经过浓缩冻干,采用离子交换树脂法分离纯化蛋白,经过凝胶过滤色谱检测,分别得到纯度为95%的藻红蛋白和97%的藻蓝蛋白,用PBS于-80 ℃保存[13];脂多糖(LPS)、MTT Sigma-Aldrich公司;Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture(DMEM)高糖培养基、PBS和0.25%胰酶(活性为103U/mg) Corning公司;胎牛血清 Hyclone公司;其他试剂 均为国产分析纯;小鼠成纤维细胞NIH-3T3、小鼠巨噬细胞RAW264.7 实验室冻存细胞,来源于 ATCC 细胞库;NO检测试剂盒 北京普利莱基因技术有限公司;小鼠TNF-αElisa检测试剂盒 Cusabio公司。

FORMA 371 STERI-CYCL细胞二氧化碳培养箱、Varioskan Flash酶标仪 赛默飞世尔科技公司;SH4B紫外光疗仪 上海希格玛高技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗炎活性考察

1.2.1.1 考察藻蓝蛋白和藻红蛋白对RAW264.7细胞增殖的影响 用含10% FBS、1%双抗的DMEM完全培养基培养RAW264.7细胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化细胞、计数、细胞铺于96孔板中,1×104个/孔,每组4个复孔。每孔加入135 μL细胞悬液,每组4个复孔。24 h后,每孔分别加入不同浓度受试样品(受试蛋白样品浓度设为0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL,配制方法为将母液解冻后用3220×g离心5 min,上层液过0.22 μm滤膜除菌,然后分装,用PBS稀释不同浓度梯度,用完全培养基进行稀释)15 μL,对照组加入15 μL PBS缓冲液,孵育24 h后,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),继续培养4 h,然后加入三联裂解液,每孔100 μL,于37 ℃过夜后,酶标仪检测在570 nm处的吸光率,依照公式:OD570=log(A/B),A为仪器给出的特定波长的光强,B为经检测后该特定波长的光强,计算出OD570的值,并以此进行图形分析。

1.2.1.2 对LPS诱导RAW264.7细胞释放NO和TNF-α的影响 用含10% FBS、1%双抗的DMEM完全培养基培养RAW264.7细胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化细胞、计数、细胞铺于96孔板中,1×104个/孔,每组4个复孔。每孔加入162 μL细胞悬液,每组4个复孔。24 h后,除对照孔外,每孔加入18 μL LPS(1 μg/mL),同时每孔分别加入(受试蛋白样品浓度预设为0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL)20 μL,模型组加入20 μL PBS缓冲液。

对照组与模型组相比,LPS替换为18 μL的PBS缓冲液。孵育24 h后收集细胞上清液,按照试剂盒说明书检测细胞上清中NO和TNF-α的含量。

1.2.2 抗紫外活性考察

1.2.2.1 藻蓝蛋白和藻红蛋白对小鼠成纤维细胞(NIH-3T3)细胞增殖的影响 用含10% FBS、1%双抗的DMEM完全培养基培养NIH-3T3细胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化细胞、计数、细胞铺于96孔板中,1×104个/孔,每组4个复孔。每孔加入135 μL细胞悬液,每组4个复孔。24 h后,每孔分别加入不同浓度受试样品(受试蛋白样品浓度预设为0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)15 μL,孵育24 h后,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),继续培养4 h,然后加入三联裂解液,每孔100 μL,于37 ℃过夜后,酶标仪检测OD570。

1.2.2.2 UVB诱导NIH-3T3细胞损伤模型建立 用含10% FBS、1%双抗的DMEM完全培养基培养NIH-3T3细胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化细胞、计数、细胞铺于96孔板中,1×104个/孔,每组4个复孔。每孔加入135 μL细胞悬液,每组4个复孔。24 h后,进行紫外辐照处理,实验用UVB波长311 nm,辐照强度13 mW/cm2,细胞距辐照光源11 cm,辐照剂量设置为100、500、1000、2000、4000 mJ/cm2,孵育后继续培养24 h,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),继续培养4 h,然后加入三联裂解液,每孔100 μL,于37 ℃过夜后,酶标仪检测OD570。

1.2.2.3 藻蓝蛋白和藻红蛋白对UVB诱导NIH-3T3细胞损伤的影响 用含10% FBS、1%双抗的DMEM完全培养基培养NIH-3T3细胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化细胞、计数、细胞铺于96孔板中,1×104个/孔,每组4个复孔。每孔加入135 μL细胞悬液,每组4个复孔。24 h后,进行紫外辐照处理,实验用UVB波长311 nm,辐照强度13 mW/cm2,细胞距辐照光源11 cm,辐照剂量设置为4000 mJ/cm2,辐照完成后立即加入不同浓度受试样品(受试蛋白样品浓度预设为0.01、0.1、1、10 μg/mL),孵育后继续培养24 h,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),继续培养4 h,然后加入三联裂解液,每孔100 μL,于37 ℃过夜后,酶标仪检测OD570。

1.3 数据处理

利用SPSS 22.0对实验数据进行统计分析,数据以Mean±SD表示。

2 结果与分析

2.1 抗炎活性考察

2.1.1 藻蓝蛋白和藻红蛋白对RAW264.7细胞增殖的影响 藻蓝蛋白和藻红蛋白与小鼠巨噬细胞RAW264.7孵育24 h,藻蓝蛋白100 μg/mL显著抑制RAW264.7细胞增殖(P<0.05),藻红蛋白100 μg/mL极显著抑制RAW264.7细胞增殖(P<0.01)(见图1)。因此后续的研究选用剂量为0.001～10 μg/mL进行实验。

图1 藻蓝蛋白和藻红蛋白对RAW264.7细胞增殖的影响(n=4),Fig.1 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on RAW264.7 cell proliferation(n=4)注:*代表与对照组相比差异显著,P<0.05;**代表与对照组相比差异极显著,P<0.01。

2.1.2 藻蓝蛋白和藻红蛋白对LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO和TNF-α的影响 如图2,与对照组相比,给予LPS(1 μg/mL)刺激后,RAW264.7细胞产生NO和TNF-α的量显著升高(P<0.01),

图2 藻蓝蛋白和藻红蛋白对RAW264.7细胞释放NO的影响(n=4)Fig.2 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on NO release from RAW264.7 cells(n=4)注:*代表与模型组相比差异显著,P<0.05，**极显著，P<0.01; #代表与对照组相比差异显著,P<0.05,##极显著,P<0.01;图3、图4、图6同。

表明细胞刺激模型建立成功。结果显示藻蓝蛋白和藻红蛋白都有一定的抑制RAW264.7细胞分泌NO和TNF-α的能力,并且其抑制能力都呈现出一定的浓度依赖关系。藻蓝蛋白1、10 μg/mL与模型组相比能显著降低NO水平(P<0.01),藻红蛋白0.1、1、10 μg/mL也能显著降低NO水平(P<0.01)。

如图3,藻蓝蛋白0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL均能极显著降低TNF-α的水平(P<0.01),藻红蛋白0.01、0.1、1、10 μg/mL四个浓度可以极显著降低TNF-α水平(P<0.01)(见图3)。藻蓝蛋白和藻红蛋白均能显著抑制LPS诱导RAW264.7分泌的NO和TNF-α的水平(P<0.01),且呈现出一定的浓度依赖关系。藻红蛋白在抑制RAW264.7细胞分泌NO的作用强于藻蓝蛋白,而藻蓝蛋白对TNF-α的分泌抑制作用强于藻红蛋白。

图3 藻蓝蛋白和藻红蛋白对RAW264.7细胞释放TNF-α的影响(mean±SD,n=4),Fig.3 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on TNF-α release from RAW264.7 cells(mean±SD,n=4)

人工养殖的葛仙米藻蓝蛋白和藻红蛋白具有明显的抗炎活性,其藻红蛋白主要以α-螺旋结构为主,β-折叠结构含量较少,主要以颗粒状不均匀分布或棒状形式分布[20],藻蓝蛋白含有极大螺旋藻α链,中性环境呈链状,聚集态主要为片层、针状和蜂窝状形式[21]。两种蛋白的结构有较大的不同,其对于抗炎的作用机理也不相同。藻蓝蛋白和藻红蛋白可以抑制 TNF-α和NO炎症因子的分泌,它们对多种活性自由基有清除能力[10],阻断了炎症反应中关键靶点,促进了其抗炎活性。同时,它们可能通过抑制细胞核内 TNF-α和NO基因的表达,进而抑制NF-κB或NO等炎症信号通路发挥抗炎活性[18]。

2.2 抗紫外活性考察

2.2.1 藻蓝蛋白和藻红蛋白对NIH-3T3细胞增殖的影响 如图4所示,藻蓝蛋白和藻红蛋白在100 μg/mL浓度时对NIH-3T3细胞增殖有极显著抑制作用(P<0.01),其他浓度对NIH-3T3细胞增殖无显著影响。因此后续的研究选用剂量为0.001～10 μg/mL进行实验。

图4 藻蓝蛋白和藻红蛋白对NIH-3T3细胞增殖的影响(n=4)Fig.4 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on NIH-3T3 cell proliferation(n=4)

2.2.2 UVB诱导NIH-3T3细胞损伤模型建立 紫外辐射不仅改变细胞形态,对细胞的活性也有影响。建立UVB诱导NIH-3T3细胞的紫外损伤模型,如图5所示,UVB 2000、4000 mJ/cm2辐照剂量可以诱导NIH-3T3细胞明显的细胞毒作用,造成NIH-3T3细胞的损伤,本实验采用4000 mJ/cm2辐照剂量。

图5 UVB不同辐照剂量对NIH-3T3细胞的损伤作用(mean±SD,n=4)Fig.5 Effects of UVB irradiation on damage of NIH-3T3 cells(mean±SD,n=4),注:*代表与对照组相比差异显著,P<0.05, **代表与对照组相比具有极显著差异,P<0.01。

2.2.3 藻蓝蛋白和藻红蛋白对UVB诱导的NIH-3T3细胞损伤的影响 利用建立的UVB诱导的NIH-3T3细胞损伤模型,考察藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗紫外辐射活性。经UVB辐照后的实验组在藻红蛋白和藻蓝蛋白的作用下,活细胞数并无显著升高,表明藻红蛋白和藻蓝蛋白对UVB诱导的细胞紫外损伤并无显著的保护作用(图6)。

图6 藻蓝蛋白和藻红蛋白对UVB诱导的NIH-3T3细胞损伤的影响(mean±SD,n=4)Fig.6 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on UVB～induced damage of NIH-3T3 cells(mean±SD,n=4)

3 结论

葛仙米藻红蛋白浓度为0.1、1和10 μg/mL时，抑制RAW264.7细胞分泌NO的作用明显强于同浓度的藻蓝蛋白,而藻蓝蛋白浓度为0.001、0.01、0.1和1 μg/mL对TNF-α的分泌抑制作用则强于同浓度的藻红蛋白。虽然UVB 4000 mJ/cm2可以成功诱导NIH-3T3细胞的紫外损伤,但是藻蓝蛋白和藻红蛋白对NIH-3T3细胞的紫外损伤并无明显保护作用。藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗炎活性与其结构有关,但本文尚未阐明葛仙米藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗炎靶点以及在动物体内的作用效果,在以后的研究中将深入研究。