量子点标记免疫层析试纸条快速检测谷物中赭曲霉毒素A

沙志聪,其木格,贾增艳,张 燕,生 威,*

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,食品营养与安全国家重点实验室,天津 300457; 2.南开大学医学院,天津市食品科学与健康重点实验室,天津 300071)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA),是由曲霉属和青霉属等某些真菌产生的次级代谢产物[1],其主要的结构类似物有赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D、甲酯化的赭曲霉毒素A、甲酯化或乙酯化的赭曲霉毒素B[2],其中OTA的毒性和危害性仅次于黄曲霉毒素B1[3],对人类和动物威胁最大[4-6],属2B类致癌物[7]。OTA能够损伤人类和动物的肝肾器官功能,致畸、致癌、致突变,并具有免疫毒性[8-10]。OTA的污染不仅出现在谷物及其制品、豆类及其制品、酒类、坚果及籽类和饮料类等物质中,还出现在动物饲料里面,当动物摄食OTA污染的饲料后,因代谢困难导致OTA在体内蓄积,会对动物的肝肾、肌肉和血液产生毒害作用[11]。为了有效控制OTA对人类以及动物产生的危害,国内外规定了OTA的限量标准,其中欧盟对于OTA在谷物、谷物产品中的最大残留限量分别是5、3 μg/kg,我国对于OTA在谷物及其制品中的最大残留限量为5 μg/kg[12-15]。

目前用于检测OTA的方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)[16-17]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[18-19],另外还有薄层色谱法(TLC)[20-21]、酶联免疫吸附法(ELISA)[22-23]和免疫层析测定法[24-25]等。免疫层析技术是结合了抗原抗体特异性反应的免疫技术和流动相中各组分与固定相的结合能力不同而分离的色谱层析技术发展形成的一种快速检测方法,其中胶体金是应用最为广泛的标记材料[26]。随着新型纳米材料研究的迅速发展,由Ⅱ-Ⅳ族或由Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒即量子点(Quantum dot,qd),在分子生物学、细胞生物学、免疫生物学和医学等领域得到广泛的应用[27]。与传统有机荧光染料相比,量子点光稳定性好、荧光强度大,同时具有激发光谱宽且连续、发射光谱窄且对称、斯托克斯位移大、发射波长可调等独特的光学特性[28-29]。量子点具有优良的标记特性,标记抗体等大分子物质后不会改变大分子物质的生物活性[30-35]。目前,OTA免疫层析试纸条在市场上以胶体金标记免疫层析试纸条为主。本研究依据羧基功能化量子点的优良性能,制备量子点标记抗体的荧光探针,建立用于检测谷物中OTA的量子点标记免疫层析试纸条新方法,以期在现场简便快速准确地实现谷物样品中OTA的定性半定量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品垫、结合垫、吸水垫、PVC背板 上海金标公司;硝酸纤维素膜 美国Millipore公司;羧基水溶性量子点(ZnCdSe/ZnS,激发波长302 nm,发射波长585 nm) 武汉珈源公司;OTA多克隆抗体(IgG Ab) 实验室自制;OTA、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、呕吐毒素、T-2毒素、羊抗兔IgG、鸡蛋卵白蛋白(OVA)、无水四氢呋喃、1-(-3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 美国Sigma公司;玉米、大米、大麦、燕麦 天津市某超市。

HM3035型双维往复划膜仪、ZQ2000型微电脑自动斩切机 上海金标公司;HHB11型电热恒温培养箱 天津市三水公司;ZF1-2型紫外分析仪 上海嘉鹏公司。

1.2 实验方法

1.2.1 包被抗原(OTA-OVA)的制备 利用活化酯法制备包被抗原[36]。首先称取1 mg OTA放于棕色玻璃瓶中,加入200 μL无水四氢呋喃使其溶解。称取0.57 mg NHS、1.89 mg EDC加入到OTA溶液中,待完全溶解后,置于磁力搅拌器上室温反应24 h。然后10000 r/min、5 min离心除去沉淀,取上清液用氮气吹干得活化物,将活化物重新溶解到300 μL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,即为活化酯溶液。称取5 mg OVA溶于2 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)中,待完全溶解后置于磁力搅拌器上,在冰浴条件下将活化酯溶液缓慢滴加到OVA溶液中。待将活化酯溶液全部加入到OVA溶液后将混合液转移至4 ℃冰箱,搅拌反应过夜。用磷酸缓冲溶液(PB,pH=7.4)透析72 h,然后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 QD-Ab的制备 采用活化酯法将羧基功能化的水溶性量子点与抗体进行偶联。选择QD与Ab的摩尔比为1∶5、1∶10、1∶15进行偶联优化。首先将25 μL QD加入到1.5 mL离心管中,加入6 μL 10 mg/mL的碳化二亚胺(EDC)溶液,再分别加入111、221、332 μL 1.37 mg/mL的OTA抗体,混合均匀。将离心管固定在摇床上,以260 r/min在室温下避光反应3 h。然后将产物溶液在4 ℃、10000 r/min条件下离心3 min,除去量子点的团聚物,得到QD和Ab反应的初步产物。最后将初步产物用0.5 mL的超滤离心管在4 ℃、8000 r/min离心5 min,浓缩至100 μL,得到QD-Ab偶联物,通过在激发波长302 nm、发射波长585 nm条件下,测定偶联物的荧光强度,根据荧光强度确定出最佳QD与Ab偶联摩尔比,然后置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.3 QD-Ab的质量鉴定 通过测定激发波长为302 nm时,QD和QD-Ab在450～700 nm波长范围内的发射波长,从而确定QD在偶联前后荧光特性是否发生改变;将1.2.2制备得到的3种QD-Ab,分别进行试纸条实验验证,根据最终的可视化信号,进一步验证最佳QD与Ab偶联摩尔比。

1.2.4 量子点标记免疫层析试纸条工作条件的优化 分别选用QD-Ab的添加量为0.5、1.0、1.5 μL和工作液添加量为1、5、10、15、20 μL的条件进行试纸条上样检测,根据试纸条C、T线荧光可视化信号强度,确定出最佳的QD-Ab和工作液添加量。

1.2.5 量子点标记免疫层析试纸条的组装检测步骤以及检测限的确定 将硝酸纤维素膜、吸水垫、结合垫和样品垫按照如图1所示顺序,粘贴在PVC背板上组装试纸条。将包被抗原和羊抗兔IgG分别包被在试纸条C和T线处,在37 ℃条件下干燥5 h,然后用自动斩切机将粘贴好的PVC背板切成3.7 mm宽的试纸条,放置于含有干燥剂的容器中保存。检测时,将100 μL含有QD-Ab、工作液的样品溶液滴加在样品垫上,10 min后,观察检测结果并记录。当试纸条的C线和T线都出现时,判断为阴性结果;当试纸条的C线出现而T线消失时,判断为阳性结果;当试纸条的C线没有出现时,试纸条检测结果无效,需要重新检测再判定检测结果。当试纸条C线出现而T线消失时对应的待测物的最小浓度定义为方法检测限。用浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L的OTA标准溶液分别加到量子点免疫层析试纸条的样品垫上,10 min后,依据C线和T线在紫外灯下的荧光强度确定试纸条的检测限。

图1 量子点标记免疫层析试纸条结构图Fig.1 The quantum-dot-labeled immunochromatographic test strip structure diagram

1.2.6 量子点标记免疫层析试纸条的特异性 为了考查量子点免疫层析试纸条的特异性,用优化好的量子点免疫层析试纸条分别检测赭曲霉毒素A(0.5 μg/L)和五种常见真菌毒素,包括黄曲霉毒素B1(1000 μg/L)、玉米赤霉烯酮(1000 μg/L)、伏马毒素B1(1000 μg/L)、呕吐毒素(1000 μg/L)和T-2毒素(1000 μg/L),通过观察检测结果判断试纸条的特异性。

1.2.7 谷物样品处理与量子点标记免疫层析试纸条方法的验证 玉米、大米、大麦、燕麦(经天津市农产品质量监督检验测试中检测为阴性样品)用粉碎机粉碎后,分别称取5 g样品置于50 mL离心管内,加入5 mL的70%甲醇,充分震荡10 min后,在1000 r/min离心10 min,取上清液用PBS(pH=8.0)稀释10倍,消除样品基质中糖类、色素和蛋白质等对试纸条产生的影响,然后直接用量子点免疫层析试纸条检测。为了验证量子点标记免疫层析试纸条方法的有效性,本文选用OTA商品化试剂盒进行验证。玉米、大米、大麦和燕麦阴性样品被分别添加浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg的OTA标准品,制备成待检样品,然后分别用量子点标记免疫层析试纸条方法和OTA商品化试剂盒进行检测,根据检测结果,判定所建立方法的准确性。

1.3 数据分析

OTA商品化试剂盒根据试剂盒操作说明,四参数拟合出标准曲线,分别进行添加和未添加OTA的玉米、大米、大麦、燕麦样品的检测,每种样品重复测定3次;选取同一谷物样品,按照所建立的量子点标记免疫层析试纸条方法进行检测,每种样品重复测定3次,得到定性半定量结果。将两种检测方法的检测结果进行比较,当检测同一样品时,根据两者结果是否一致,判断OTA量子点标记免疫层析试纸条检测方法的有效性。

2 结果与分析

2.1 QD-Ab的制备与质量鉴定

在QD-Ab制备过程中,QD与Ab之间不同的摩尔比直接影响QD-Ab的荧光强度,由图2可知,当QD:Ab的摩尔比为1∶10时,偶联物荧光强度最高,连接效果最好。

图2 QD和Ab偶联比的优化Fig.2 Optimization of the coupling ratio of QD to antibody

在激发波长为302 nm,QD和QD-Ab荧光发射光谱如图3所示,结果显示QD和QD-Ab两者具有相同的最大发射波长,且荧光强度接近,表明QD与Ab偶联后仍保持原有的荧光特性。

图3 QD和QD-Ab的荧光发射光谱Fig.3 Fluorescent emission spectrum of QD and QD-Ab conjugate

分别选用QD-Ab、QD-OVA、QD和PBS(pH=8.0)与工作液和缓冲溶液混合后,加到试纸条样品垫上,10 min后观察结果。如图4所示,QD-Ab能够与试纸条T线处包被抗原特异性结合,表明QD标记Ab成功,且Ab保持原有生物活性。其他三种物质不能在试纸条上出现荧光,表明这三种物质不能够与包被抗原结合,且没有非特异性吸附。

图4 质量鉴定图Fig.4 Result of quality identification 注:从左到右依次为QD-Ab、QD-OVA、QD、PBS。

2.2 量子点标记免疫层析试纸条工作条件的确定

为了获得最佳检测结果,QD-Ab添加量和工作液的添加量被优化,结果见表1。当QD-Ab添加量为1 μL,工作液添加量为10 μL,量子点标记免疫层析试纸条的C、T线荧光强度适中,条带清晰,梯度明显。

表1 QD-Ab和工作液添加量的优化Table 1 Optimization of dosage of QD-Ab and working buffer

2.3 量子点标记免疫层析试纸条可视化检测限的确定

结果如图5所示,当OTA浓度为0 μg/L时,试纸条的C线和T线上都出现了荧光强度适中的条带。随着OTA浓度的增大,试纸条T线的荧光强度逐渐减弱,当OTA浓度为0.5 μg/L时,试纸条T线荧光完全消失。因此,在缓冲溶液中,量子点标记免疫层析试纸条检测OTA的检测限为0.5 μg/L。

图5 量子点标记免疫层析试纸条检测限Fig.5 Detection limit of quantum dot-labeled immunochromatographic test strip注:赭曲霉毒素A的浓度从左到右 依次为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L。

2.4 量子点标记免疫层析试纸条特异性的确定

结果如图6所示,低浓度的OTA使得试纸条的T线荧光消失,而检测其他高浓度的真菌毒素,试纸条T线上荧光条带仍然清晰可见,说明试纸条不能识别其他真菌毒素,同时说明了量子点标记免疫层析试纸条对OTA具有很好的特异性。

图6 量子点免疫层析试纸条特异性Fig.6 The cross-reactivity of OTA quantum dot strip注:从左到右依次为PBS、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、 玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、呕吐毒素、T-2毒素。

2.5 量子点标记免疫层析试纸条检测实际样品

结果如图7所示,当谷物样品中OTA的添加浓度为5.0 μg/kg时,试纸条T线荧光消失,因此,谷物样品中OTA的检测限为5.0 μg/kg。

图7 谷物样品的检测结果Fig.7 The test results of cereal samples注:a:玉米样品;b:大米样品;c:大麦样品;d:燕麦样品； 浓度从左到右依次为0、0.5、1、2、5 μg/kg。

2.6 量子点标记免疫层析试纸条方法的验证

分别用本研究建立的量子点标记免疫层析试纸条方法和OTA商品化试剂盒对待检样品中OTA残留量进行检测。结果如表2所示,说明本文建立的量子点标记免疫层析试纸条方法具有有效性。

表2 加标样品的分析(n=3)Table 2 Analysis of the spiked samples(n=3)

3 结论

本实验通过优化量子点标记抗体过程中的QD与Ab的摩尔比,制备了光学特性优良的QD-Ab荧光探针,优化了量子点标记免疫层析试纸条的工作条件,建立了可用于检测玉米、大米、大麦、燕麦样品中OTA的量子点标记免疫层析试纸条检测方法。当QD与Ab的摩尔比为1∶10时,QD-Ab荧光特性最佳;在QD-Ab和工作液添加量分别为1、10 μL时,量子点标记免疫层析试纸条结果最佳;量子点标记免疫层析试纸条的检测限为0.5 μg/L,谷物样品中的检测限为5 μg/kg,整个检测过程不超过10 min;该方法操作简便、检测时间短、灵敏度高、结果易于判断,只需要一个便携式紫外灯就可以实现谷物中OTA的定性半定量可视化检测,可以满足谷物中OTA残留量的现场快速检测的要求。