莫沙必利联合米曲菌胰酶片对功能性消化不良模型小肠Cajal间质细胞的影响及其机制的研究*

李伟冬,江舒曼,贾 林

(广东省广州市第一人民医院消化内科 510180)

Ⅳ诊断标准将功能性消化不良(FD)定义为起源于胃十二指肠的症状[1]，其病因复杂，病程迁延，复发率高，严重影响患者生存质量。国内FD的发病率约20%，其门诊量占消化专科的60%～70%[2]。国内外已有不少研究报道莫沙必利联合米曲菌胰酶片治疗FD，能够影响患者胃肠激素的表达水平，改善患者胃动力障碍，但关于其内在机制的研究报道极少。有报道认为核因子-κB(NF-κB)的激活可以促进影响胃肠道损伤的炎性因子的表达水平上调，在FD的发病机制中起到了关键性的作用[3]。本研究设想莫沙必利联合米曲菌胰酶片可通过影响NF-κB的表达，调控一系列促炎细胞因子及胃肠激素的表达水平，从而达到治疗FD的效果。本研究构建了Cajal间质细胞(ICC)FD模型[4]，并检测了莫沙必利和米曲菌胰酶片单用及联用治疗前后细胞胃肠激素及NF-κB等促炎因子的表达变化，初步探索其作用机制，希望能为进一步的临床研究提供实验基础并为FD治疗提供新的治疗靶点，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 Balb/c小鼠及SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(粤)2016-004。培养在温度为22 ℃、湿度为60%～70%的环境中，每天12 h光照/黑暗交替，自由摄食。

1.2方法

1.2.1原代小鼠小肠ICC培养、鉴定及分组 选用Balb/c小鼠5只，雌雄不限，禁食24 h后处死；取出小肠，于显微镜下剥离小肠黏膜层后，将小肠组织剪成碎片；将Ⅱ型胶原酶(批号1202775，美国Gibco公司)加入盛有小肠碎片组织的烧杯中，于37 ℃消化30 min,离心，用Hank′s液(批号12350039，美国Gibco公司)重悬沉淀，过200目筛除去大块组织；用M199培养基(批号1302027，美国Gibco公司)培养细胞，放入5% CO2，37 ℃条件下培养，隔天换液，继续培养。将ICC放置于显微镜下观察细胞形态学变化；通过免疫荧光的方法检测原代培养ICCc-kit的表达来鉴定ICC[4-5]。

1.2.2FD大鼠模型及细胞模型的构建 40只SD大鼠分成正常动物组，10只，造模后予生理盐水2 mL灌胃，3次/天；FD动物模型组，10只，造模后予生理盐水2 mL灌胃，3次/天；莫沙必利动物组，10只，造模后予莫沙必利(瑞琪，江苏豪森药业)灌胃，每天剂量0.27 mg/kg，3次/天；米曲菌胰酶片动物组，10只，1片米曲菌胰酶片(慷彼申，德国NORDMARK ARZNEIMITTEL GmbH & Co.KG公司)溶于6 mL温开水，造模后分3次使用，时间同Ⅲ组；联合治疗动物组，10只，造模后予莫沙必利及米曲菌胰酶灌胃，剂量与次数同Ⅲ、Ⅳ组。除正常组外，其余4组大鼠都采用夹尾刺激引发大鼠打斗法进行FD造模，造模7 d后开始给药，连续10 d灌胃后处死并制备相应血清。

用含有5%胎牛血清的全成分细胞培养液培养ICC24 h，使其同步化。将制备好的对应正常细胞组(A组)、FD细胞模型组(B组)、莫沙必利组(C组)、米曲菌胰酶片组(D组)及联合治疗组(E组)血清，按组别加入ICC培养瓶中培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.3检测方法 按说明书利用ELISA方法(武汉华美生物)检测各组ICC上清液中胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、P物质(SP)、5-羟色胺(5-HT)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的水平。利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜(德国Leica公司)观察NF-κB在各组细胞中的表达分布。利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测各组处理后的ICC上清中NF-κB激酶抑制因子(IKK)、NF-κB和NF-κB抑制因子(IκB)基因mRNA的表达水平。

2 结果

2.1原代ICC形态及免疫荧光鉴定结果 荧光显微镜下见大多数原代ICC的胞体呈现纺锤形或星形，细胞核多为圆形且体积较大，约占所有细胞的2/3，胞体边缘较为清晰，有3～5个明显的突起且突起相互间存在联系，形成网状结构。随着细胞培养时间的延长，ICC形态特征更加突出。原代培养ICC在荧光显微镜下可见明显的c-kit阳性信号，见图1。

2.2FD细胞模型 A组ICC整体呈纺锤形，细胞边缘突起较多，且突起间相互连接成网，细胞核较大，细胞边缘清晰可见；B组FD模型ICC整体趋向扁平化，细胞突起较少，网状结构受损，细胞间缝隙明显缩小，见图2。

图1 荧光显微镜下原代ICC形态(免疫荧光染色，×400)

2.35组胃肠激素及炎性因子表达水平比较 与A组比较，B组MTL、SP、5-HT的表达水平明显降低，GAS、NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平明显升高(P<0.05)；与B组比较，C组MTL和5-HT表达水平明显上升，GAS、IL-1β和TNF-α的表达水平有所下降(P<0.05)。D组SP和5-HT表达水平较B组明显升高且NO、IL-6和TNF-α表达水平明显下降(P<0.05)；与C、D组比较，E组MTL、SP、5-HT的表达水平均明显升高，GAS、NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平均明显降低(P<0.05)，见表1。

2.45组NF-κB(p65)表达分布情况 免疫荧光结果显示：与A组比较，B组NF-κB的表达明显上升；而与B组比较，C、D、E组NF-κB的表达均有所降低，其中E组降低最为明显(P<0.05)，见图3。

A:A组;B:B组

图2荧光显微镜下ICC形态(免疫荧光染色，×400)

表1 各组胃肠道激素和炎性因子的表达

a：P<0.05，与A组比较；b：P<0.05，与B组比较；c：P<0.05，与C组比较;d：P<0.05，与D组比较

A～E:A～E组

图3 5组NF-κB(p65)表达分布情况(免疫荧光染色，×400)

a：P<0.05，与A组比较；b：P<0.05，与B组比较；c：P<0.05，与C组比较;d：P<0.05，与D组比较

图4 5组IKK、IκB、NF-κB(p65)mRNA表达

2.55组IKK、IκB、NF-κB(p65)mRNA表达水平比较 与A组比较，B组血清中的IκB mRNA的表达水平较低，而IKK、NF-κB mRNA的表达水平较高(P<0.05)。与B组比较，C、D组IκB mRNA表达水平较高，而IKK、NF-κB mRNA的表达水平较低(P<0.05)；E组IκB mRNA的表达水平较高，而IKK、NF-κB mRNA的表达水平较低，且较C、D组差异更为明显(P<0.05)，见图4。

3 讨论

FD的发病因素众多，包括上消化道运动障碍、内脏高敏感性、胃酸分泌过多、幽门螺旋杆菌感染、社会、心理、饮食等诸多因素，其中胃肠道动力障碍和内脏高敏感性被认为是其主要病理基础[6]，也有多项研究及罗马Ⅳ标准强调幽门螺旋杆菌感染因素的重要性[1，7-8]。

胃肠激素是参与消化道机械运动、消化液分泌等生理活动的肽类激素，主要包括MTL、GAS、CGRP、Ghrelin等，其与相对应受体结合后可通过调控神经递质的合成与释放参与到胃肠机械运动的调节作用中，其表达水平与FD的发生、发展密切相关[9-11]。研究证实NF-κB信号途径可能参与胃肠激素的合成与分泌，其激活可以上调胃肠道损伤的炎性因子水平，在FD的发病机制中起关键作用[2,12-14]。莫沙必利及米曲菌胰酶片在临床上已被广泛用于治疗包括FD在内的一系列功能性胃肠病[15-17]。国内外已有不少文献报道莫沙必利联合米曲菌胰酶片治疗FD，能够影响患者胃肠激素的表达水平，有效改善患者胃动力障碍，从而缓解FD症状。本研究检测了FD细胞模型中部分胃肠激素(MTL、GAS)及神经递质(SP、5-HT)的表达情况，并研究了莫沙必利、米曲菌胰酶片单独治疗及联合治疗前后MTL、GAS、SP、5-HT的表达变化。结果显示，经莫沙必利或米曲菌胰酶片单独处理后，MTL、SP、5-HT的表达水平均得到一定程度的恢复，而在莫沙必利和米曲菌胰酶片两者联合处理之后MTL、SP、5-HT得到更大程度的恢复。表明两者联合处理的治疗效果强于各自单独治疗，可以起到协同作用，且两者很可能通过改善胃肠激素的表达来发挥其治疗作用。核转录因子NF-κB的激活可以促进影响胃肠道损伤的炎性因子表达水平上调，被认为在FD的发病机制中起到了关键性的作用。因此，本研究猜测莫沙必利联合米曲菌胰酶片是否是通过影响NF-κB的表达，进一步调控一系列促炎细胞因子的表达水平，改善胃肠激素的失衡，从而达到治疗FD的效果。本研究在ICC上建立了FD细胞模型，发现NF-κB信号通路被激活，经莫沙必利或米曲菌胰酶片单独处理后，NF-κB信号通路得到一定程度的抑制，而在莫沙必利和米曲菌胰酶片联合处理之后，NF-κB信号通路被抑制的程度更大。由此可以推测莫沙必利联合米曲菌胰酶片治疗FD的分子机制，可能是通过抑制NF-κB信号通路，下调炎性反应因子的表达，从而恢复相关胃肠道激素和神经递质的表达水平。

综上所述，莫沙必利和米曲菌胰酶片联合治疗对FD模型大鼠中失调的胃肠激素及炎性因子具有明显调节作用，联用效果较单药治疗更为明显。本实验从细胞水平对莫沙必利联合米曲菌胰酶片治疗FD的机制进行研究，试验结果与众多临床试验相印证；从NF-κB信号通路与胃肠激素合成释放的关系切入，充分探讨了联合治疗的作用机制，为进一步临床研究提供条件。