聚乙二醇2000/磷酸氢二钾双水相体系萃取溶菌酶

吕晓萌，鲍宗源，郝晓妤，布振乾，梁悦姿

（东北农业大学应用化学系，黑龙江哈尔滨 150000）

双水相萃取 （Aqueous Two-phase Extraction，ATPS） 技术[1]，又称为水溶液两相分配技术（Partition of two aqueous system）是近年出现的、极有应用前途的新型生物化工分离技术。它是利用双水相的成相现象及待分离物质在两相间分配系数的差异进行物质分离与纯化的技术，即当2种聚合物或一种聚合物与一种盐在水中以一定浓度混合时，可形成互不相溶的两相，其中一相富含一种聚合物，一相富含另一种聚合物或盐，这种两相体系称之为双水相体系 （Aqueous Two-phase systems，ATPS）[2]。

双水相萃取技术的第一次应用是在20世纪60年代，1956年瑞典伦德大学Albertsson首次应用双水相萃取技术成功分离了叶绿素[3]，1979年德国国家生物工程研究中心（GBF） 的Kula等人应用双水相萃取技术分离了生物酶。随后，双水相萃取技术因其操作条件比较温和、产品活性损失少、具有较好的可调性、易于工艺放大和连续操作等特点，在蛋白质、核酸和病毒的分离和纯化中得到广泛应用。

1 材料与方法

1.1 仪器

T6型新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；SC-3610型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；AUY120型电子天平，上海梅特勒-托利多仪器公司产品；A110280型涡流混匀器，南京稼竣生物科技有限公司产品。

1.2 材料与试剂

聚乙二醇2000（C.P），国药集团化学试剂有限公司提供；考马斯亮蓝G-250（H.S），中国惠世生化试剂有限公司提供；磷酸氢二钾（A.R），天津市永大化学试剂有限公司提供；磷酸（85%） （A.R），天津市耀华化学试剂有限公司提供；溶菌酶，北京博奥拓达科技有限公司提供。

1.3 试验方法

1.3.1 相图的绘制

采用浊点法[2]绘制双水相相图。

1.3.2 溶菌酶标准曲线的绘制

考马斯亮蓝溶液的配制：将100 mg考马斯亮蓝G-250溶解在50 mL（95%） 乙醇中，加入100 mL 85%（W/V）的浓磷酸，最后加超纯水定容至1 000 mL，混匀后用双层滤纸过滤，棕色瓶避光保存。

溶菌酶标准曲线的测定：配制一定浓度梯度的溶菌酶溶液，以每管中溶菌酶的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并作线性回归，求线性方程。

1.3.3 双水相体系的构建

在10 mL玻璃离心管中，依次加入5 mL一定质量分数的PEG 2000溶液、3 mL一定质量分数的K2HPO4溶液和2 mL一定浓度的溶菌酶，总体积为10 mL，最后加入一定质量的NaCl固体；充分摇匀后，置于离心机中以转速2 000 r/min离心20 min，读取上下相体积，使用考马斯亮蓝法检测上下相溶菌酶含量。

1.3.4 双水相体系上下相溶菌酶含量的测定

使用考马斯亮蓝法[4]测定上下相溶菌酶含量。可通过测定波长595 nm处的吸光度计算溶菌酶浓度。

1.3.5 双水相体系计算公式

式中：V上——上相体积，mL；

V下——下相体积，mL；

C上——上相中溶菌酶质量浓度，mg/mL；

C下——下相中溶菌酶质量浓度，mg/mL；

C——溶菌酶质量浓度，mg/mL；

V——相体积，mL；

C0——加入溶菌酶质量浓度，mg/mL；

V0——加入溶菌酶体积，mL。

2 结果与分析

2.1 双水相相图的绘制

PEG 2000/K2HPO4双水相体系相图见图1。

从图1可以看出，PEG 2000和K2HPO4可以很容易成相。

图1 PEG 2000/K2HPO4双水相体系相图

2.2 溶菌酶标准曲线的绘制

溶菌酶标准曲线见图2。

图2 溶菌酶标准曲线

从图2可以看出，回归方程为Y=5.2499X+0.0396，R2=0.982，线性良好，可以用于测定样品的蛋白质含量。

2.3 影响双水相体系萃取溶菌酶因素的探究

2.3.1 K2HPO4质量分数对分配效果的影响

K2HPO4质量分数对体系上相溶菌酶萃取率的影响见图3。

图3 K2HPO4质量分数对体系上相溶菌酶萃取率的影响

从图3可以看出，当双水相体系中PEG 2000质量分数不变为45%时，随着K2HPO4质量分数增加，萃取率变化很小，这说明K2HPO4的质量分数对溶菌酶在双水相体系中的分配影响较小。

2.3.2 PEG 2000质量分数对分配效果的影响

PEG 2000质量分数对体系上相溶菌酶萃取率的影响见图4。

图4 PEG2000质量分数对体系上相溶菌酶萃取率的影响

从图4可以看出，溶菌酶主要富集在上相，当K2HPO4质量分数一定时，萃取率随着PEG 2000质量分数增加而变大，当PEG 2000达到45%时，萃取率有所下降。由于溶菌酶主要分配在上相，PEG 2000质量分数增加，体系黏度增加，因而相间分子转移的阻力也增加，随着PEG 2000质量分数继续增加，萃取率随之降低。所以，PEG 2000最佳质量分数为45%（W/W）。

2.3.3 溶菌酶质量浓度对分配效果的影响

溶菌酶质量浓度对体系上相溶菌酶萃取率的影响见图5。

图5 溶菌酶质量浓度对体系上相溶菌酶萃取率的影响

从图5可以看出，溶菌酶的萃取率刚开始会有所上升，但随着溶菌酶质量浓度的增加，萃取率会有所下降。

2.3.4 NaCl用量对分配效果的影响

不同NaCl用量对体系上相溶菌酶萃取率的影响见图6。

从图6可以看出，体系中NaCl用量达到0.2 g时，溶菌酶在上相的富集达到上限，即上相溶菌酶萃取率不再随NaCl用量的增加而升高。所以，NaCl 0.2 g/10 mL更有利于溶菌酶的萃取。

图6 不同NaCl用量对体系上相溶菌酶萃取率的影响

3 结论

（1） 在PEG 2000/K2HPO4双水相体系萃取溶菌酶的众多因素中，其中影响最大的是PEG 2000的质量分数，而K2HPO4质量分数对溶菌酶萃取率的影响不大。

（2）不同溶菌酶质量浓度对萃取率也有影响。

（3）NaCl用量对溶菌酶萃取率影响较大。

（4）PEG 2000/K2HPO4双水相体系对溶菌酶能够达到较好的萃取能力。当质量分数45%（W/W）磷酸氢二钾3 mL，45%（W/W） PEG 2000 5 mL，质量浓度1 mg/mL溶菌酶2 mL，NaCl用量为0.2 g/10 mL时，溶菌酶主要分配在双水相体系的上相，相比为1，分配系数为6.53，萃取率为75.3%。