溶菌酶及其应用研究进展

赵荣文,谭丽萍,刘同军

齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南 250353

溶菌酶(lysozyme)存在于卵清、唾液等生物分泌液中,能够催化细菌细胞壁肽聚糖 N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键的水解。当与带负电荷的病毒蛋白相互结合时,溶菌酶能够与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐[1],这种复盐可使病毒失去活力。根据溶菌酶的结构和起源分为六大类[2],即c型溶菌酶；g型溶菌酶；i型溶菌酶；植物源溶菌酶；微生物源溶菌酶和噬菌体T4溶菌酶。溶菌酶的作用很广泛,越来越多人的研究人员开始关注溶菌酶,综述了溶菌酶常用的分离纯化方法以及其应用。

1 分离纯化方法

1.1 超滤法

超滤法是根据分子大小不同,使用不同大小孔径的膜进行分离纯化。陈姗姗[3]将毕赤氏基因重组酵母发酵液经过离心分离、超滤、膜分离、阳离子交换树脂吸附后,得到溶菌酶,经真空干燥后酶活可达 20 000 U/mg,通过这一系列步骤吸附后,大大提高了纯化效率。

1.2 亲和萃取法

在亲和萃取中,一种配基与另一种成相聚合物以共价相结合,由于这种配基与要提取的目的产品有较高的亲和力,这样体系双水相处理量大,而且亲和层析专一性高。有研究人员建立了一种利用辛巴蓝修饰的新型离子液体[C4MIM]3CB高效萃取鸡蛋清中溶菌酶的方法[4],并利用蛋白结构模型,计算其与[C4MIM]3CB的结合能,与其它已有的萃取分离方法相比,此法选择性高、操作简便、产品纯度高,为蛋清中溶菌酶的提取分离提供了一条新的、高效的途径。

1.3 离子交换法

离子交换法是根据溶液中不同带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异来达到分离纯化效果的一种方法。溶菌酶属于碱性蛋白质,可使用弱酸型阳离子交换树脂对其进行分离。邓晗等[5]研究了一种重组人溶菌酶的分离纯化方法,采用固液分离、膜过滤、疏水层析及离子交换层析对重组人溶菌酶进行分离纯化,结果表明该方法可获得重组人溶菌酶的单一组分,纯化后的重组人溶菌酶可与人溶菌酶抗体特异性结合,方法简单易操作,成本低。

1.4 吸附法

吸附法是选用一些吸附剂来吸附溶菌酶,由于这些吸附剂吸附力较弱,或者易引起蛋白质变性而应用不广,由此,研究人员开始选用凝胶或者通过组装新的复合材料来分离提取溶菌酶,还有人通过分子印迹来选择识别分离溶菌酶,大大提高了溶菌酶的提取率。

Li等[6]通过Ca2+和戊二醛(GA)制备了藻酸盐(SA)/羧甲基纤维素(CMC)凝胶珠交联并研究了它们在水溶液中对溶菌酶的吸附性能。利用SA和CMC上具有丰富的活性羧基,所获得的SA/CMC凝胶珠具有优异的整合溶菌酶的高吸附性能。与此同时,可以制备一种以壳聚糖、柠檬酸和人发纤维组合的复合材料来吸附溶菌酶[7],有效的提高溶菌酶的提取率。Kamini Mishra等[8]利用纳米金属离子和溶菌酶的相互作用来吸附溶菌酶,溶菌酶被物理吸附在纳米颗粒表面上。已知溶菌酶和纳米金属离子之间相互作用是因为强大的静电引力作用,这里反映出熵有可能成为吸附过程中的重要因素的结论。溶菌酶的识别和分离也可以通过羟乙基丙烯酸酯和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯在聚多巴胺修饰的二氧化钛纳米颗粒上的自由基聚合来实现[9],制备溶菌酶印迹二氧化钛纳米粒子用于溶菌酶的选择性识别和分离。大大提高了溶菌酶的提取率,实现了在蛋白质分离过程中的有效识别,甚至能够从稀释的蛋清中分离溶菌酶。

2 应 用

2.1 在食品方面的应用

溶菌酶在食品中应用极其广泛,无论是将其作为单一的防腐剂还是配合其他的试剂一起发挥作用,包括将溶菌酶的某些特性提高后再与其他聚合物配合使用,都有显而易见的效果,溶菌酶在食品行业的应用技术已经比较成熟,作为一种无毒蛋白质,可以选择性地分解微生物的细胞壁。

王者[10]将溶菌酶脂质体添加到菜籽色拉油中研究其脂溶性,结果显示溶菌酶脂质体脂溶性较好,可减缓感官的下降速率,抑制菌落总数增加和硫代巴比妥酸值和pH值的上升等。同时Khairuddin N等[11]在小麦基活性包装薄膜中加入溶菌酶,加入溶菌酶的薄膜具有防潮的性质,坚韧有力。Badun等[12]对溶菌酶吸附的动力学和等温线以及溶菌酶与载体结合的强度进行研究,结果显示溶菌酶的吸附使材料的表面更亲水,而且达到吸附平衡的速度取决于溶菌酶溶液渗透到碳材料孔隙中的能力。聚乙烯表面的溶菌酶吸附是可逆的,而在活性炭和石墨箔的表面上不可逆。杨伟杰等[13]发现溶菌酶与甘氨酸可组合提升对G-细菌的溶解力。溶菌酶与葡萄糖氧化酶、乳过氧化氢酶组合使用可强化水产品防腐保鲜效果。溶菌酶固定在聚合物上也可以应用于食品包装的表面,溶菌酶被包埋在不同的聚合物中[14],如聚乙烯醇薄膜,显示出抗微生物活性。

2.2 溶菌酶的生物学功能

溶菌酶有杀菌免疫功能,是生物体内重要的非特异性免疫因子。当溶菌酶被应用于生物学方面时更多的是将溶菌酶进行生物学改造后发挥更大的作用,例如使用克隆技术深入分析溶菌酶的生物结构,可以精准有效的利用其特性进行应用。

Cabrefiga等[15]利用BP100(同源多功能十一肽)与溶菌酶的协同效应,BP100与溶菌酶的结合减少了达到细胞死亡所需的时间和最低抑菌浓度,BP100肽与溶菌酶结合后,即使在植物提取物存在下,BP100对抗解淀粉欧文氏菌的杀菌活性也会增加,并且在植物预防火疫病的侵袭上也会有所增强。

不止在疾病方面有所作用,有研究者通过克隆某些溶菌酶增加了在免疫学方面的研究价值,Liu等[16]首次克隆并鉴定了P.fulvidraco LysG基因(一种g-型溶菌酶),经验证,PfLysG在调节病原体感染的先天免疫反应中起重要作用,PfLysG在肾,脾和肠中高度表达。在分别用脂多糖和多核糖核苷酸多聚胞苷酸模拟病原体攻击后,PfLysG的mRNA表达在免疫组织的不同时间点显著上调。结果表明,P.fulvidraco的g-型溶菌酶参与先天免疫应答。刘然然等[17]通过对大鲵c-型、g-型溶菌酶基因进行克隆及鉴定,分析其结构特征,推测其保守性。结果表明,大鲵c-型和g-型溶菌酶及两栖动物溶菌酶具有较高的同源性,两者在肝脏和胃中表达量最高,大鲵c-型溶菌酶在肌肉和脑中表达量最低,大鲵g-型溶菌酶在肌肉和皮肤中表达量最低。

Jordan等[18]利用溶菌酶及相关溶解度等实验,研究了多价阴离子影响蛋白质之间相互作用和蛋白质净电荷的能力。在低离子强度条件下,高价阴离子通过改变溶菌酶分子之间的静电相互作用,能够更有效地降低溶菌酶和溶菌酶之间的排斥,而多价阴离子会导致溶菌酶净电荷的逆转和高离子强度下的过充电。不止是溶菌酶相互之间会产生相互作用,溶菌酶与肽酶的相互作用可以抑制瘤胃原生动物,Park等[19]确定了不同的溶菌酶和肽酶化学抑制剂对瘤胃原生动物及其相关原核生物的影响,尾状芽孢杆菌依赖于溶菌酶和肽酶来消化和利用被吞噬的微生物,特异性抑制这些酶可以抑制尾状芽孢杆菌。也就意味着通过特异性抑制溶菌酶和肽酶来抑制瘤胃原生动物。

2.3 在生物材料方面的应用

溶菌酶可以作为模型蛋白,促进蛋白质晶体、蛋白质结构与功能的关系和蛋白质与界面的相互作用机制等研究[20]。刘辉等[21]以卵清溶菌酶为生物模板,硼氢化钠为还原剂,制备铑镍合金纳米纤维、钯铜合金纳米纤维。制备出纳米纤维相比于商业催化剂分别有更好的氧化还原性和催化氧化活性。

研究表明可以用金纳米颗粒制备的PVA-溶菌酶微泡显示出比没有金纳米粒子的PVA-溶菌酶微泡有更大的光学消光值[22],这些值随着金纳米粒子的浓度增加而增加,两种类型的微泡都显示出对革兰氏阴性大肠杆菌的抗菌活性,含有金纳米粒子的气泡比前者表现更好。

Ely等[23]研究从牛和羊的临床标本中分离出54株莫拉菌,对浮游细胞和无梗细胞的生物膜形成能力和溶菌酶敏感性进行了体外评价。结果表明浮游形态的莫拉菌具有溶菌酶活性。但是在固结生物膜方面溶菌酶没有能力消除预形成的生物膜。

徐子明等[24]选取卵清溶菌酶通过人工干预和设计塑造成特定状态的纤维模板,进行了铂、钯、金贵金属纳米材料的温和可控自组装,结果表明,卵清溶菌酶纤维模板对铂纳米晶形貌有主导作用。对所制备的铂、钯纳米晶进行相关的电催化性能测试,不同结构形貌的纳米晶因粒子大小、排列方式等不同表现出不同的电催化活性。

Somu等[25]使用蛋清溶菌酶和牛载脂蛋白α乳清蛋白通过优化的脱溶剂技术制备超分子蛋白纳米组装体,该组装体证明了基于植物化学的抗癌剂的高负载能力,比如姜黄素负载的组装体在24 h内诱导了包括小鼠黑素瘤在内的所有癌细胞的细胞活力降低了90%以上。所以载有姜黄素的超分子蛋白纳米组装体将成为一种新的癌症疗法,它通过双重治疗机制的战略模式发挥作用。细菌纤维素在治理水污染方面发挥作用,Silva 等[26]制备了双纳米纤维生物吸附膜,是利用纤维素纳米纤维和溶菌酶纳米纤维组成的,用于去除水溶液中的汞。在pH11接触24 h后,pH依赖性去除率达到99%,接近溶菌酶蛋白的等电点,其残留浓度低于人类饮用水的指导值。

2.4 溶菌酶在其他方面的研究及应用

近几年来,人们对溶菌酶的不同方面进行了不同程度的改进及研究,包括对溶菌酶进行改性、溶菌酶制品的检测方法等。

张齐等[27]把i-型溶菌酶与海参溶菌酶比较,i-型溶菌酶对指示菌溶壁微球菌具有明显的抑菌作用。溶菌酶在海参先天免疫系统中起重要作用,是机体应对病原菌的重要免疫应答因子。Dyakova等[28]利用X射线小角散射研究沉淀阳离子类型对溶菌酶溶液结构的影响,当加入沉淀剂时,在溶菌酶溶液中除单体外,还有大量二聚体和八聚体。随着离子半径的增大,一价离子Li+-Na+-K+系列中八聚体的分数增加,这与不同的盐存在时溶菌酶的溶解度数据一致。八聚物分数随着沉淀剂浓度的增加和温度的降低而增加,在所有类型的沉淀剂中都有所体现。Guo等[29]利用光谱技术研究了溶菌酶与离子液体[C4mim]BF4、[C4mim]Cl、[C4mim]Br和[dmim]I在水溶液中的结合区域。加入离子液体可以增强肽键价电子跃迁,从而提高溶菌酶在210 nm处的吸收峰强度。四种离子液体均可灭活溶菌酶的荧光团,且随着离子液体浓度的增加,灭活效果更加明显。且溶菌酶分子活性位点上的两个Trp62和Trp108残基主要参与溶菌酶分子与离子液体的相互作用。

Jie等[30]探究了3种取代度的羧甲基纤维素与溶菌酶之间的静电相互作用,结果显示取代度越高,与溶菌酶的静电相互作用越强,溶菌酶的抑菌性随着羧甲基纤维素取代度的增加而逐渐降低。Aich等[31]通过研究得出溶菌酶有在胶体金纳米粒子表面吸附和胶体金纳米粒子的聚集这两个相互作用。在胶体金纳米粒子表面吸附溶菌酶,利用静电作用在溶菌酶和胶体金纳米粒子之间形成基态络合物,进入到胶体金纳米粒子表面形成电晕和重新定位。聚集是由溶菌酶分子通过与柠檬酸封顶胶体金纳米粒子的表面结合,中和表面电荷。

李晓颖等[32]建立重组人溶菌酶滴眼液的无菌检测方法,经验证,重组人溶菌酶滴眼液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均表现出不同程度的抑菌作用。Epaud等[33]确定了给药外源性溶菌酶会进一步增强体内细菌的杀灭,急性肺部感染时内源性溶菌酶增加,早期给药外源性溶菌酶进一步提高体内细菌的杀灭能力。且人溶菌酶比鸡蛋溶菌酶和兔溶菌酶对枯草芽孢杆菌的抗性更强,数据还表明,对于需要气管插管和难以治疗的肺炎患者,气管内给予溶菌酶可能是一种可行的常规治疗的辅助手段。

刘纪红等[34]通过对溶菌酶进行改性,把溶菌酶进行化学修饰,增强溶菌酶的杀菌能力,拓展溶菌酶的抗菌谱和溶菌范围。张永勤等[35]将溶菌酶把表面脱乙酰化甲壳素颗粒作为载体,戊二醛为交联剂进行固定化,可提高溶菌酶的热稳定性和贮藏稳定性。Xue等[36]研究了固定化溶菌酶和天然溶菌酶对提高污泥脱水能力的性能,分析表明污泥絮凝结构在天然和固定的溶菌酶处理下被破坏,提高了污泥的沉降能力,固定的溶菌酶在经过循环后仍具有活性。

Andrea等[37]制备不同氨基酸功能化氧化铁磁性纳米粒子验证了纳米颗粒能够显著抑制溶菌酶淀粉样蛋白纤维化并破坏淀粉样原纤维。纳米颗粒会影响溶菌酶的滞后和生长曲线的稳态阶段。Wu 等[38]通过优化溶菌酶纳米脂质体的制备,模拟胃肠液和肠液的溶菌酶的稳定性发现,在37 ℃时胃肠液和肠液具有一定的稳定性,表明制备和优化的溶菌酶纳米脂质体是稳定的。

近几年,改性溶菌酶的出现,重组人溶菌酶等,这些改进拓宽了溶菌酶的应用范围,溶菌酶和其他物质相结合组装成新的材料进行其他应用,为溶菌酶在科研等各个方面的研究提供了依据。

3 总结及展望

对溶菌酶的分离纯化以及最近的研究进展进行的综合分析可以发现溶菌酶凭借着独特的性质展示了广泛的使用价值,近几年,研究者已经把溶菌酶应用到了各个方面,特别是当把溶菌酶进行改性之后,溶菌酶相应的特性被扩大,比如将溶菌酶进行化学修饰,从而增强溶菌酶的杀菌能力,拓展溶菌酶的抗菌谱和溶菌范围,再将变性后的溶菌酶使用到食品、生物材料、生物医学等领域,溶菌酶发挥的作用就更明显,其利用价值也相应增加。

近几年,溶菌酶的应用越来越广泛,但是溶菌酶的产量问题是限制其应用的重要因素,利用基因工程,化学修饰等方法提高溶菌酶的产量迫在眉睫。研究者制备了溶菌酶-果胶复合体,但未对该复合体进行全面评价,需要进一步探究其特性,有望进一步开发纳米凝胶负载抗癌药物及开发急缓控释,靶向定位于一体的功能化纳米载体。为了提高溶菌酶活性,利用酶解溶菌酶形成多肽产物来提高溶菌酶的抑菌效果,再加以应用到某些生物药物中,会具有重大的研究意义。