载盐酸阿霉素液态氟碳脂质体对乳腺癌治疗效果

苏 琳，贾 丹，许晓华*，胡 聪，黄 菊，谭筱林，贾亦真，王志刚，任建丽

(1.香港大学深圳医院超声科，广东 深圳 518053；2.重庆医科大学超声影像学研究所，重庆 400010)

超声分子成像作为分子影像技术之一，具有无创、无毒、无辐射、实时、可重复应用等优势，且以靶向超声造影剂为示踪剂，可在分子水平对体内组织器官进行探查、显像[1-2]。液态氟碳(fluorocarbon, PFH)作为一种可相变材料，在体外超声辐照下，可发生液气相变，增强超声造影。阿霉素(hydrochloride, DOX)为两亲性蒽环类抗生素，抗肿瘤适应证较广，在血浆中消失迅速[3-4]，广泛分布于心、肝、脾、肺、肾脏中，但其心脏毒性较大[5-7]。脂质体包封抗肿瘤药物可望提高药物的靶向性、降低毒性。提高脂质体靶向性，需延长脂质体在血液中的循环时间[8-9]。对脂质体膜进行改性修饰，可达到延长血液循环时间的作用，增强对肿瘤的治疗作用[10-12]。本实验采用薄膜振荡法制备载DOX的脂质体，观察该纳米粒不同时间增强超声显影情况以及对人乳腺癌MAD-MB-231细胞治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 氢化大豆卵磷脂(hydrogenated soybean phosphatidylcholine, HSPC)、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)(油脂株式会社)，DOX(Sigma公司)，cck-8试剂盒、Annexin-V/PI凋亡试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。二棕榈酰磷脂酰甘油(dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, DPPG)、PFH(ElfAtochem公司)，人乳腺癌MDA-MB-231细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究院)。

RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，低强度聚焦超声(low intensity focused ultrasound, LIFU)诊断仪(重庆医科大学影像研究所)，Zetasizer Nano ZS90光粒径测量仪(Malvern)，UV2500 UV-VIS紫外可见光分光光度计(岛津公司)，高效液相色谱仪(TSP)，百胜Mylab90型彩色超声诊断仪(探头频率5～9 MHz)。

1.2 方法

1.2.1 脂质体的制备 将DOX、HSPC、DPPG、PEG2000-DSPE、胆固醇以一定的质量比例(1.0:5.0:2.0:1.5:1.5)溶于10 ml氯仿，装入圆底烧瓶，密封；完全溶解后，将烧瓶置于旋转蒸发仪减压蒸发2 h，蒸干氯仿，转速80 rpm；待圆底烧瓶底部形成均匀脂膜后加入PBS溶液，将其置于恒温箱内缓慢振荡直至水化完全；在冰浴条件下进行声振乳化(100 W，8 min)，乳化过程中同时逐滴加PFH，最后获得乳白色混悬液，即为载药液态氟碳Lip-PFH纳米粒。通过低温离心机(5 min，80 rpm)，采用不同质量配比的DOX和磷脂(DOX:磷脂为1:3、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:20)制备Lip-PFH-DOX纳米粒，并于冰箱保存。

1.2.2 基本特征观察 将制备的Lip-PFH-DOX纳米粒置于10 ml离心管，观察其颜色，有无聚集和沉淀。透射电镜下观察纳米粒的形态，并用马尔文粒径仪测量该纳米粒的粒径和电位。光镜下观察其形态并采用加热板促使其相变，检测相变温度。

1.2.3 包封率和体外药物释放 将不同质量配比的DOX和磷脂溶液以紫外分光光度计测量其吸光度并绘制标准曲线，计算包封率：药物包封率=(Lip-PFH-DOX纳米粒中包封的DOX质量/Lip-PFH-DOX纳米粒中加入DOX的总量)×100%。取适量载DOX脂质体置于透析袋中，并随机分为Lip-PFH-DOX组和Lip-PFH-DOX+LIFU组，分别取100 ml葡萄糖溶液为透析外液，Lip-PFH-DOX+LIFU组给予超声辐照(功率1 W/cm2，频率1 MHz，占空比50%，时间30 s)。分别于5 h、24 h、48 h、72 h取2 ml透析外液，通过高效液相色谱法测定药物在不同时间点的释放率。

1.2.4 细胞毒性及增殖实验 体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞，取对数生长期细胞接种于96孔板。随机分为Lip-PFH组、Lip-PFH-DOX组，每组5个孔。次日加入不同浓度(1、5、25、50、100 μg/ml)纳米粒，分别培养24 h和48 h。PBS冲洗96孔板3次后，加入CCK-8试剂10 μl，继续培养1 h后于酶标仪测定450 nm处的吸光度。计算细胞存活率：细胞存活率=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

表1 2组不同时间DOX的释放率(±s)

表1 2组不同时间DOX的释放率(±s)

组别5 h24 h48 h72 hLip-PFH-DOX+LIFU组14.51±1.2329.43±2.4452.71±4.2352.74±4.03Lip-PFH-DOX组8.12±0.7420.41±1.6540.05±3.2241.71±3.36t值-12.04-5.74-4.33-5.34P值<0.01<0.010.010.06

图1 Lip-PFH-DOX纳米粒表征 A.透射电镜下观察; B.粒径分布图; C.电位分布图

1.2.5 细胞调亡实验 取对数生长期细胞，以1×105/孔接种于6孔板孵育，随机分为Lip-PFH组、Lip-PFH-DOX组，并加入200 μl(浓度0.01 mg/ml)纳米粒。分别于孵育24 h和48 h后，PBS洗去未连接纳米粒，胰酶消化细胞后使用Annexin-V/PI凋亡试剂盒进行染色。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 体内外增强超声显像 称取一定量琼脂，加入适量脱气水，微波炉加热，搅拌至气泡消失，将EP管底部插入凝胶并固定，待其冷却凝固后取出制得带孔的凝胶模型。向凝胶孔内加入200 μl(浓度0.01 mg/ml)Lip-PFH-DOX纳米粒，采用不同能量的LIFU(3、5、10 W)辐照10 min(工作5 s，间停 5 s)；采集辐照后声像图。建立裸鼠人乳腺癌MDA-MB-231模型，经裸鼠尾静脉注射适量纳米粒，采用不同能量的LIFU(3、5、10 W)辐照10 min(工作5 s，间停5 s)肿瘤部位使纳米粒发生相变，观察肿瘤部位增强超声表现。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。计量资料以±s表示，药物释放率的比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 Lip-PFH-DOX纳米粒的制备及表征 Lip-PFH-DOX纳米粒呈红色悬浊液，分散性好，在透射电镜下观察大小均一，壳层可见黑色颗粒分布(图1A)。Lip-PFH-DOX纳米粒的粒径(340.81±68.54)nm(图1B)，电位(-17.72±7.66)mV(图1C)。

2.2 包封率和体外药物释放 当DOX和磷脂质量比例为1:10时，DOX的包封率最大(86.80±2.55)%。Lip-PFH-DOX纳米粒在超声辐照下，可发生液气相变，并破裂。Lip-PFH-DOX组在48 h时DOX释放达高峰。与Lip-PFH-DOX组相比，Lip-PFH-DOX+LIFU组药物释放率明显增高(表1)。

2.3 细胞毒性及增殖实验 当Lip-PFH纳米粒的最大浓度达100 μg/ml时，细胞存活率仍可达95.18%。当与不同浓度的Lip-PFH-DOX纳米粒细胞孵育24 h，细胞存活率逐渐下降；孵育48 h，当浓度为100 μg/ml时，存活率降低至45.00%(表2)。

表2 2组不同浓度纳米粒孵育24 h和48 h的细胞存活率(%)

2.4 细胞凋亡实验 Lip-PFH组在孵育24 h和48 h后，细胞凋亡数量极少，Lip-PFH-DOX组在孵育48 h时细胞发生大量凋亡(图2)。

2.5 体内外增强超声显像 超声辐照功率为3 W时，辐照10 min时Lip-PFH-DOX未发生变化；5 W时，有微弱信号产生；10 W时，大量纳米粒发生相变，产生明显的超声信号(图3)。在体内也验证了这一结果。相同条件下，通过裸鼠尾静脉注射该纳米粒后，在肿瘤上方采用超声刺激，同时观察肿瘤内部超声信号的变化(图4)。结果表明，注射进入体内的纳米粒在EPR作用下聚集于肿瘤区域，通过超声辐照，瘤内超声信号可明显增强。

图2 流式细胞仪检测2组细胞凋亡情况 A.Lip-PFH组孵育24 h; B.Lip-PFH组孵育48 h; C.Lip-PFH-DOX组孵育24 h; D. Lip-PFH-DOX组孵育48 h

3 讨论

研究[13]发现，制备所得Lip-PFH纳米粒粒径小，可穿过肿瘤血管内皮间隙靶向结合肿瘤细胞，一定条件下发生相变形成微泡，既可提高超声分子成像质量，又能定位释放药物进行靶向治疗。PFH纳米粒生物相容性好，在体内通过肺部呼吸的方式清除。因此，液气相变PFH纳米粒能较好地解决微泡粒径与增强超声成像之间的矛盾，有望成为一种理想的新型超声分子探针[14-15]。为实现理想超声分子成像与靶向治疗，除研制新型超声分子探针外，还需结合超声分子成像设备、超声微泡触发装置以及后处理技术[16]。

本研究采用已成熟掌握的薄膜水化法和声振法制备的Lip-PFH-DOX纳米粒大小均一，分散性好[17-18]；在透射电镜下纳米粒表面有细小颗粒，提示DOX可被成功包裹；采用不同配比的药脂比获得DOX的最大包封率(86.80±2.55)%，提示DOX可被大量包裹进入脂质体，为靶向肿瘤药物治疗提供了基础，且随时间的延长，DOX的释放量逐渐增加，在48 h后达到最高值，并稳定释放，可促进DOX的治疗效果。通过CCK-8实验[19]和流式细胞检测结果发现，Lip-PFH-DOX纳米粒对细胞的杀伤作用，证实脂质体的包裹不仅对DOX的细胞毒性作用无影响，还可缓慢释放杀伤肿瘤细胞。超声监测对药物的治疗作用至关重要，包裹PFH的纳米粒可在超声激发下发生相变，促进药物靶向释放，实时监测纳米粒在肿瘤的聚集情况。

本研究体外、体内超声成像实验结果显示注射Lip-PFH-DOX纳米粒后，在裸鼠肿瘤部位具有更明显的显影效果，证实该超声造影剂具有一定的超声成像的功能和在肿瘤组织中积累的效应，提示其在肿瘤的早期诊断与治疗方面有潜在的应用价值，并证实包裹DOX和PFH的脂质体在超声实时监测药物聚集情况的同时可定点释放药物，减少药物对正常器官的毒副作用，为乳腺癌的体内治疗奠定基础，有望成为一种新型的诊疗一体化分子探针。

图3 Lip-PFH-DOX纳米粒体外增强超声显影 A.辐照功率3 W，辐照时间10 min； B.辐照功率5 W，辐照时间10 min； C.辐照功率10 W，辐照时间10 min

图4 Lip-PFH-DOX纳米粒体内增强超声显影 A.注射纳米粒前声像图； B.辐照功率3 W，辐照时间10 min； C.辐照功率5 W，辐照时间10 min； D.辐照功率10 W，辐照时间10 min

总之，本研究成功制备了包裹DOX和PFH纳米粒，可实现体内外超声显影，同时该纳米粒可对MAD-MB-231细胞产生杀伤作用。