五味子酯甲对TGF-β1诱导人肝星状细胞增殖的影响

车金营，杨 硕，许智莹，李 贺，孙靖辉，陈建光，王春梅

(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

肝纤维化是慢性肝病或肝损伤后组织修复过程中的一种代偿性反应.通常，受外界各种致病因素刺激后，肝脏内炎性细胞活化并释放相关因子激活肝星状细胞，引起大量细胞外基质过度沉积，形成纤维化[1].晚期肝纤维化可发展为肝硬化、肝癌甚至死亡.

五味子(SchisandraChinensis)是木兰科植物五味子的干燥成熟果实，木脂素是五味子中主要的特征性活性成分[2].相关研究[3-5]表明：五味子及其提取物具有显著的抗肝纤维化、肺纤维化及肾纤维化等作用，但对其发挥作用的主要活性成分方面鲜有报道.五味子酯甲(Schisantherin A，SCA)是五味子木脂素中主要的单体化合物之一，已有研究[6-8]证实：SCA对酒精、对乙酰氨基酚等诱导的肝损伤都有保护作用，且具有显著的抗炎活性，但其是否具有抗肝纤维化作用尚未报道.本研究采用体外培养LX2细胞，建立TGF-β1诱导LX2细胞增殖模型，观察SCA对LX2细胞增殖、活化的影响，并探讨其抗纤维化作用.

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

五味子酯甲(成都普菲德生物技术有限公司)；人肝星状细胞LX2细胞系(吉林大学基础医学院药理学实验室赠予)；胎牛血清(GEMINI公司)；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；高糖DMEM培养液(HyClone公司)；TGF-β1(PEPROTECH公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Amresco公司)；肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素-6(Interleukin-6，IL-6) ELISA试剂盒(上海朗顿生物技术公司)；α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和核因子-κB p65(Nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)及GAPDH(ABclone公司)；其他试剂(北京鼎国昌盛试剂公司).

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

将LX2细胞接种于含有10%胎牛血清的高糖DMEM(含1%双抗)培养液中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养.取对数生长的LX2细胞用0.25%胰蛋白酶消化，以100 μL/孔细胞悬液(6×104/mL)接种至96孔板中，随机分成10组，并设置复孔，除对照组(CON)外，其余9组每孔分别加入不同浓度的SCA(SCA浓度分别为0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，20.000，40.000，80.000和160.000 μmol/L)培养24 h或48 h，采用MTT法检测LX2细胞增殖作用，结果SCA(0.625～2.500 μmol/L)孵育24或48 h，对LX2细胞无细胞毒性，所以选取SCA浓度小于2.500 μmol/L进行实验.

1.2.2 MTT法检测SCA对TGF-β1诱导LX2细胞增殖的影响

将LX2细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以100 μL/孔细胞悬液(6×104/mL)接种至96孔板中，将细胞随机设立为CON组(含0.1% DMSO)、TGF-β1组(5 ng/mL)与0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L SCA给药组，培养24 h.采用MTT法检测各组LX2细胞增殖作用.

1.2.3 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α和IL-6水平

将消化后的LX2细胞以6×104/mL接种于96孔板中，随机分为CON组、TGF-β1组与0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L SCA给药组，孵育24 h，取上清液，应用ELISA试剂盒(朗顿生物技术公司)检测各组TNF-α和IL-6水平.

1.2.4 Western blotting法检测α-SMA，NF-κB p65的蛋白表达水平

将胰蛋白酶消化后的LX2细胞以1×106/mL接种于25 cm2培养瓶中，待细胞贴壁后，弃去培养液.将细胞随机分为CON组、TGF-β1组与0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L SCA给药组，孵育24 h.提取LX2细胞总蛋白.具体步骤：弃去培养瓶中细胞上清液，PBS洗3次，加入RIPA裂解液，冰上裂解细胞30 min，离心(4 ℃、12 000 r/min、5 min)收集上清液，BCA法测定样本蛋白浓度.在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离目标蛋白，转膜2 h，随后封闭1 h(5 %脱脂奶粉)；加入α-SMA，NF-κB p65第一抗体，4 ℃过夜；次日用TBST洗膜3次，10 min/次，并与第二抗体室温孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次，最后加ECL显影液显影，分析.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 SCA对TGF-β1诱导LX2细胞增殖的影响

与CON组比较，TGF-β1刺激24 h后LX2细胞显著增殖(P<0.01).而与TGF-β1组比较，SCA (0.25，0.50，1.00和2.00 μmol/L)各给药组对LX2细胞具有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01).说明SCA能够抑制TGF-β1诱导的LX2细胞增殖、活化.见图1.

2.2 SCA对TGF-β1诱导LX2细胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影响

与CON组比较，TGF-β1组TNF-α和IL-6水平明显增加(P<0.01).与TGF-β1组比较，SCA各组的TNF-α及IL-6水平均不同程度的降低，且1.00和2.00 μmol/L SCA给药组TNF-α和IL-6水平降低明显 (P<0.01).提示SCA可能通过抑制炎症反应发挥抗肝纤维化作用.见表1.

注：与CON组比较，**：P<0.01；与TGF-β1组比较，#：P<0.05，##：P<0.01图1SCA对TGF-β1诱导LX2细胞增殖的影响Fig.1Effects of SCA on the proliferation of LX2 cells induced by TGF-β1

表1SCA对TGF-β1诱导LX2细胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影响

Tab.1 Effect of SCA on TNF-α and IL-6 levels in supernatant of LX2 cells induced by TGF-β1 (ng·mL-1))

注：与CON组比较，**：P<0.01；与TGF-β1组比较，##：P<0.01

2.3 SCA对TGF-β1诱导LX2细胞α-SMA，NF-κB p65蛋白表达的影响

为进一步观察SCA是否具有抗肝纤维化作用，我们采用Western Blotting法检测α-SMA的蛋白表达量.结果显示:与CON组比较，TGF-β1组α-SMA蛋白表达量显著增加(P<0.01)；与TGF-β1组比较，不同剂量SCA组α-SMA蛋白表达量均有所降低，其中0.50，1.00及2.00 μmol/L SCA给药组α-SMA蛋白表达量降低显著 (P<0.05)，提示SCA具有一定的抗肝纤维化作用.见图2A.

同时，为探讨NF-κB信号通路在SCA抗肝纤维化中是否发挥作用，我们检测了NF-κB p65蛋白表达量.与CON组比较，TGF-β1组NF-κB p65蛋白表达量明显增加(P<0.05).与TGF-β1组比较，SCA各组NF-κB p65蛋白表达量均有所降低，其中1.00 μmol/L及2.00 μmol/L SCA给药组NF-κB p65蛋白表达量明显下降(P<0.05).提示SCA可能通过抑制NF-κB p65蛋白表达发挥抗肝纤维化作用.见图2B.

注：与CON组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；与TGF-β1组比较，#：P<0.05图2SCA对LX2细胞中α-SMA，NF-κB p65蛋白表达的影响Fig.2Effect of SCA on the expression of α-SMA and NF-κB p65 in LX2 cells

3 讨 论

木脂素是五味子发挥保护肝损伤作用的主要活性成分.SCA是五味子木脂素单体化合物之一，除了保护肝损伤，还具有显著的抗炎活性[9].肝纤维化主要是由于肝星状细胞的激活，产生过量的α-SMA及细胞外基质沉积于肝脏内，致使纤维结缔组织异常增生[10].因此，抑制肝星状细胞增殖、活化对抗肝纤维化具有重要意义.本研究采用体外培养LX2细胞，建立TGF-β1诱导LX2细胞增殖模型，观察SCA对LX2细胞增殖、活化作用.本研究结果显示：SCA能够显著抑制LX2细胞增殖活化，降低α-SMA蛋白表达水平，提示SCA具有一定的抗肝纤维化作用.

在肝纤维化进程中，肝组织内会释放大量的炎性介质及细胞因子，包括TNF-α和IL-6等[11]，这些炎症因子会刺激肝星状细胞，促进肝纤维化，在这一过程中NF-κB信号通路发挥重要的作用[12].本研究结果显示：SCA能够明显降低TNF-α及IL-6的水平，并抑制NF-κB p65的蛋白表达，说明SCA可能通过抑制炎症相关因子TNF-α，IL-6的表达及NF-κB信号通路的激活而发挥抗肝纤维化作用.

综上所述，SCA能够抑制TGF-β1诱导的LX2细胞增殖、活化及α-SMA表达，其抗肝纤维化作用机制可能与抑制炎症反应及NF-κB信号通路有关，这为五味子木脂素类化合物抗肝纤维化的研究提供了一定的理论基础.